非人灵长类克隆及治疗性克隆的机理研究

1、项目名称：非人灵长类克隆及治疗性克隆的机理研究首席科学家：周琪 中国科学院动物研究所起止年限：2006.1至2010.12依托部门：中国科学院一、研究内容深入了解在灵长类体细胞克隆胚分化与去分化过程中基因与蛋白表达、转录调控及信号传导的分子机理是本项目拟解决的关键科学问题。本项目的研究重点包括：1. 完善动物克隆技术，尝试建立具有自主知识产权的无性繁殖技术以改进核移植流程，提高克隆效率为主，探讨建立非细胞体系的无性繁殖技术的可能性。2体细胞的去分化探索和发现卵母细胞中与体细胞去分化相关的关键蛋白、化学物质。对于启动重编程相关的关键蛋白和化学物质进行深入研究，设计调控基因表达的主要成分表，控制发

2、育进程。3维持胚胎干细胞多能性的机制研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心，研究由其调控的下游基因及其相互关系。4胚胎的发育研究细胞核在细胞质环境中的三维结构变化，找到细胞核重编程的结构基础，研究分化是如何发生的及基因的动态表达过程，找出决定分化的基因网络。 具体回答的问题包括：1. 建立有效、经济的灵长类动物核移植方法，解决核移植效率低下的问题。2. 灵长类克隆胚在重编程过程中卵母细胞质因子的作用，找到参与体细胞核移植后重编程过程的关键蛋白质并阐明其在这一过程中所起的作用。3. 表观遗传修饰印记的消

3、除对灵长类动物克隆胚发育的影响。4. 在胚胎干细胞维持其多能性的过程中，重要转录因子的调控机制。5. 胚胎干细胞向神经干细胞发育过程中的信号通路和基因调控。6. 揭示灵长类基因组的差次表达模式和中枢神经系统发育的分子基础。主要研究内容：1. 对灵长类动物卵及早期胚胎生化特性及基因组表观遗传修饰进行研究；灵长类动物种间核移植研究；筛选、制备灵长类动物核供体细胞；建立有效、经济的灵长类动物核移植方法。2. 克隆灵长类动物；从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系。3. 在胚胎基因组激活过程中，比较正常胚胎和核移植胚胎基因表达谱的差异；分析差异表达基因在核内的定位；分离在胚胎早期发育过程中起重要作用的新的转

4、录因子；研究受精卵和克隆胚在着床前胚胎发育过程中基因的表达和调控。4. 研究表观遗传修饰印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响。5. 研究Nanog、Oct4等转录因子的各个结构域在行使功能时发挥的作用; 以胚胎干细胞未分化的标志性转录因子Oct4及Nanog为核心，研究由其调控的下游100个基因及其相互关系；Oct4、Nanog调控基因表达的实验研究; Oct4,Nanog在胚胎干细胞中的表达调控研究。6. 采用蛋白质组学技术研究成熟卵母细胞、激活卵母细胞、受精卵的蛋白质表达谱，用生物信息学方法构建相关蛋白质组学数据库，并通过比较这些蛋白，或者蛋白磷酸化等差异，获得其中参与细胞由分化转为未分

5、化的程中起关键作用的蛋白质，并对其蛋白表达，翻译后修饰和功能进行进一步研究。7. 研究在HGF和bFGF条件下，胚胎干细胞向神经干细胞分化的基因表达差异和HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化。重点为HGF和bFGF与其受体结合后引起哪些位点的酪氨酸残基发生了磷酸化，以及不同浓度的HGF和bFGF引起磷酸化的强弱。8. 研究导致神经干细胞分化的信号通路。包括：HGF和bFGF引起的相应受体磷酸化的信号通路，重点研究Ras，ERK，MAPK，PI3 kinase，PLC-，STAT3，Src，RhoA-ROCK等通路对神经干细胞分化的影响；脂筏（lipid rafts）在HGF和bFGF存在的条件

6、下，对神经干细胞分化的影响。Notch和Wnt信号通路，对神经干细胞的分化的作用。9. 采用DNA芯片技术对恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和体细胞克隆胚不同发育时期（从囊胚期、原肠胚、神经胚到大脑形成）的基因表达模式进行分析，寻找在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族；同时，比较人和恒河猴胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞前后基因表达图谱的差异，揭示参与神经系统分化的基因和基因家族。二、预期目标总体目标:利用核移植手段获得体细胞克隆恒河猴，揭示动物克隆和治疗性克隆研究中的细胞去分化和分化的分子机制。五年预期目标:1. 建立高效的灵长类核移植方法，克隆恒河猴；从克隆胚胎中分离E

7、S细胞系；2. 揭示Nanog、Oct4等多能性转录因子的结构基础及在蛋白水平上的调控机制；并确定和克隆它们的下游因子，探讨其作用机制；3. 获得诱导体细胞重编程的关键蛋白并阐明其作用机制；4. 发现恒河猴体细胞核移植后早期胚胎发育过程中表达的重要基因及其功能和作用方式；研究遗传印记对克隆胚发育的影响；5. 了解恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的主要信号途径；6. 筛选在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族；7. 培养研究生80-100名。8. 在本领域的国际代表性学术刊物上发表60-80篇学术论文，其中影响因子高于8的不少于10篇。三、研究方案学术思路和技术途径：动物克隆效率低下的一

8、个重要原因是由于技术手段的限制而无法在研究中形成一个系统的理论，对个别影响因素、个别蛋白、个别基因的研究不足以揭示核移植胚胎这样一个复杂的生物系统的运行机制。克隆胚发育是一个由各种基因、蛋白质和其他化学分子相互作用的复杂系统的整体行为，对动物克隆和治疗性克隆的研究不仅需要认识个别的基因和蛋白质的功能，而且需要了解完整的基因组和蛋白质组的活动。本项目将细胞生物学与分子生物学、基因组学与蛋白质组学等研究方法相结合，从基因与蛋白质表达谱分析、转录调控等方面，较系统地揭示细胞分化和去分化的分子机制；解决灵长类动物克隆的难题，并促进治疗性克隆的研究和应用（见图2）。图2， 总体研究方案和课题设置图与国内

9、外同类研究相比的创新点与特色：与以往同类研究相比，本项目采用系统生物的研究策略，应用基因组学和蛋白质组学等手段，较系统地研究细胞分化和去分化的分子机制。同时，发挥我国灵长类动物的资源优势，依靠国家对灵长类研究的支持和973项目对科学前沿探索的鼓励，联合国内外相关领域优势单位的科学家，利用和整合已有的科学与技术平台，通过学科交叉、集中优势，解决动物克隆和治疗性克隆研究中的关键科学问题。可行性分析由于本项目采取了系统生物学的研究方法和手段，有望较深入地了解分化和去分化的分子机理，从而能够突破灵长类动物无法克隆的瓶颈，得到体细胞克隆的灵长类动物。目前项目主要研究人员已在提高灵长类动物体细胞克隆胚胎的

10、发育率上取得了较好进展，并且克隆胚胎能够表达关键的胚胎发育蛋白（NuMA），为本项目取得重大突破奠定了基础。课题设置课题名称负责人主要承担单位经费比例%非人灵长类克隆研究周琪中国科学院动物研究所中国科学院昆明动物所21.0非人灵长类克隆胚重编程过程早期表达重要基因的克隆及功能研究周琪JeanPaul Renard中国科学院动物研究所Unité de Biologie du Développement (INRA-CNRS), Jouy en Josas, France15.5 分离和鉴定体细胞去分化关键蛋白冷静南京医科大学17.5维持胚胎干细胞全能性的机理研究裴端卿中科院广

11、州生物医药与健康研究院17.5恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的机制研究宿兵Pierre Savatier中国科学院昆明动物研究所Inserm Unité 371Embryonic stem cells: self-renewal and early commitment (INSERM)10.5非人灵长类胚胎发育过程中基因组的程序化表达及早期中枢神经系统分化的分子机制宿兵中国科学院昆明动物研究所18.0课题1.非人灵长类克隆研究主要研究内容：1. 灵长类动物早期胚胎主要特征研究1）灵长类动物卵及克隆胚的生物学特性的研究2）灵长类动物克隆胚胎基因组甲基化研究3）灵长类动物种间核移植研

12、究2. 核供体细胞的制备和优化1）用于核移植的体细胞和胚胎干细胞的筛选和制备2）灵长类动物成纤维细胞培养方法的建立和优化3. 通过核移植证明去分化1）灵长类动物克隆2）从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系目标：建立高效的灵长类核移植方法，克隆恒河猴；从克隆胚胎中分离ES细胞系课题2. 非人灵长类克隆胚重编程过程早期表达重要基因的克隆及功能研究主要研究内容：1. 胚胎基因组早期表达基因的研究 1）早期表达基因的筛选、鉴定2）早期表达基因的染色体定位2. 在胚胎早期发育过程中起关键作用的新的转录因子的研究1）新的转录子的分离2）新的转录子的鉴定及其生物学功能的研究3. 印记的消除对灵长类动物克隆胚发育

13、的影响1）去甲基化药物的筛选2）印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响4. 表观遗传网络的研究目标：发现恒河猴体细胞核移植后早期胚胎发育过程中表达的重要基因及其功能和作用方式；研究遗传印记对克隆胚发育的影响课题3. 分离和鉴定体细胞去分化关键蛋白主要研究内容：1. 卵母细胞的蛋白表达谱研究1）样品采集2）蛋白表达谱及分析3）建立蛋白质组学数据库及生物信息学研究2. 重编程过程中的关键蛋白1）数据采集和分析2）筛选重编程过程中的关键蛋白3）分析这些关键蛋白在重编程过程中的作用目标：获得诱导体细胞重编程的关键蛋白并阐明其作用机制课题4.维持胚胎干细胞全能性的机理研究主要研究内容：1. Oct4 和

14、Nanog的结构与功能的研究 1）研究Oct4和Nanog的转录激活结构域、调节结构域和蛋白相互作用结构域2）各功能性结构域与胚胎干多能性或分化的相关性研究3）筛选能够调节Oct4和Nanog表达的蛋白2. Nanog和Oct4调控的下游基因的研究1）筛选胚胎干细胞和体细胞差异表达的基因2）Oct4 和Nanog下游基因的鉴定3）克隆与胚胎干细胞多能性相关的基因3. Nanog和Oct4表达调控机制的研究1）Nanog和Oct4启动子的克隆2）鉴别在胚胎干细胞中特异性调控Nanog和Oct4表达的顺式作用元件3）寻找其他与Oct4或Nanog启动子结合的转录因子目标：揭示Nanog、Oct4等

15、多能性转录因子的结构基础及在蛋白水平上的调控机制；并确定和克隆它们的下游因子，探讨其作用机制课题5. 恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的机制研究主要研究内容：1. 恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的分子调控机制和信号通路的研究1）HGF 或 bFGF 与BMP信号在恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化过程中的相互作用的研究2）HGF 或bFGF激活的下游信号通路的研究3）脂筏对神经干细胞分化的影响4）Wnt信号在神经干细胞分化过程中的作用2.鉴定对中枢神经系统发育和分化起重要作用的基因目标:了解恒河猴胚胎干细胞向神经干细胞分化的主要信号途径课题6.非人灵长类胚胎发育过程中基因组的程序化表达及早期中

16、枢神经系统分化的分子机制主要研究内容：采用DNA芯片技术对恒河猴（Macaca mulatta）正常胚和体细胞克隆胚不同发育时期（从囊胚期、原肠胚、神经胚到大脑形成）的基因表达模式进行分析，寻找在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族；同时，比较人和恒河猴胚胎干细胞诱导分化为神经样细胞前后基因表达图谱的差异，揭示参与神经系统分化的基因和基因家族;建立非人灵长类（恒河猴）在神经系统发育早期各个重要发育时期的基因组表达图谱，筛选各个发育时期特异表达的基因和基因家族，揭示灵长类神经系统早期发育在基因表达水平的分子机制。目标：筛选出在神经系统发育过程中特征性表达的基因和基因家族四、年度计划年度研

17、究内容预期目标第一年1. 灵长类动物卵及克隆胚的生物学特性的研究2. 灵长类动物卵及克隆胚胎基因组甲基化研究3. 恒河猴胚胎早期表达基因的筛选、鉴定及染色体定位4. 收集成熟卵母细胞、活化卵母细胞和受精卵，在现有的蛋白质组学技术平台的基础上，进一步建立和完善保障本项目顺利实施的相关蛋白质组学技术5. 研究Oct4和Nanog的转录激活、调节结构域和蛋白相互作用结构域，并在细胞水平上探讨各功能性结构域与胚胎干细胞多能性或分化的相关性6. HGF和bFGF在诱导猕猴胚胎干细胞向神经干细胞分化过程的信号通路及其与BMP信号通路的关系7. HGF和bFGF所激活的下游信号途径的研究8. 恒河猴正常神经

18、细胞和体细胞克隆方法获得的胚胎干细胞的基因表达谱的比较1. 确定卵母细胞骨架成分的分布，并测出一些细胞周期蛋白的活性2. 确定灵长类动物最佳的超数排卵方案3. 确定克隆胚胎基因组的甲基化状态4. 筛选出正常胚胎与克隆胚胎差异表达的基因及其在染色体上的定位和表达谱5. 获得供蛋白质组学分析所需的细胞样本；建立和完善包括少量细胞的双向电泳技术，低丰度蛋白的鉴定技术和可对蛋白质进行局部氨基酸序列测定和翻译后修饰鉴定的串联质谱技术等在内的蛋白质组学相关技术6. 鉴定出Oct4和Nanog发挥作用时的各种结构域的功能。分别鉴定出它们的基因调控结构域，蛋白相互作用结构域。并在细胞水平上阐明各个结构域维持干

19、细胞多能性的作用机制7. 证明BMP信号通路在HGF和bFGF引起的神经干细胞分化中的作用，解释HGF或bFGF信号途径与BMP途径的关系；8. 发现 HGF和bFGF引起的相应的受体磷酸化位点及其与HGF和bFGF浓度的关系。9. 通过基因表达谱的比较筛选出正常分化的神经细胞中特异表达的基因和基因家族，从而为体外人工诱导由体细胞克隆获得的胚胎干细胞分化为具有正常功能的神经细胞提供可用的分子标记和诱导基因。10. 发表学术论文7-10篇第二年1. 灵长类动物种间核移植研究2. 用于核移植供体的单克隆体细胞系的制备3. 从克隆胚胎中分离胚胎干细胞并建系4. 在胚胎早期发育过程中起关键作用的新的转

20、录子的分离和鉴定5. 建立卵母细胞的蛋白质表达谱，应用生物信息学手段对卵母细胞中表达的蛋白进行分析，并利用所得数据构建蛋白质组学数据库。6. 筛选能够调节Oct4或Nanog表达的蛋白。并揭示它们的调节机制。利用生物信息学技术手段筛选受Oct4或Nanog调控的候选基因7. 继续进行HGF和bFGF所激活的下游信号途径的研究。8. 根据第一年的研究结果，进一步比较正常神经细胞和体外诱导分化的神经细胞在基因表达谱上的异同。1. 明确灵长类体细胞在不同动物卵母细胞中去分化的差异2. 从成体猴子的组织或流产胎儿获得和培养成纤维细胞，并建立单克隆细胞系3. 利用克隆囊胚建立非人灵长类动物的胚胎干细胞系

21、4. 分离到几种在胚胎早期发育过程中起关键作用的转录因子5. 建立全球共享的，符合国际双向电泳数据库联盟标准的卵母细胞蛋白质组学数据库6. 利用酵母双杂交技术筛选能与Oct4或Nanog相互作用的蛋白质。利用生物信息及分子生物学技术筛选出多能细胞及非多能细胞之间的差异表达基因，并从中筛选出受Nanog、Oct4调控的下游基因。7. 筛选出HGF和bFGF激活受体酪氨酸激酶后可能引发的影响神经干细胞分化的下游信号通路。8. 证明HGF和bFGF引起神经干细胞分化的可能途径。9. 通过与正常神经细胞的表达谱的比较，筛选出在体外诱导分化神经细胞中不正常表达的基因，为进一步改进体外诱导分化系统提供依据

22、10. 发表学术论文10-13篇第三年1. 灵长类动物供体细胞和胚胎干细胞的长期培养2. 转染体细胞单克隆细胞系和胚胎干细胞3. 在胚胎早期发育过程中起关键作用的新的转录子生物学功能的研究4. 去甲基化药物的筛选5. 分析比较成熟卵母细胞、活化卵母细胞和受精卵的蛋白质表达谱，用western印记和免疫组化等方法验证它们之间存在表达差异，并对这些蛋白的表达模式和细胞定位进行研究6. 研究能与Oct4或Nanog相互作用的各种蛋白对它们的调节机制。并探讨这些蛋白在干细胞多能性方面的作用机制。利用分子生物学手段从候选基因中鉴定受Oct4或Nanog 调控的下游基因。7. 开展脂筏对神经干细胞分化的影

23、响和Wnt信号通路对神经干细胞分化的作用及其与HGF和bFGF途径的关系的研究。8. 采集恒河猴从囊胚期直至胎儿大脑形成期各关键发育时期的组织材料，优化由少量组织（囊胚和原肠胚）进行DNA芯片分析的技术方法，并着手进行初步的芯片分析。1. 获得可长期培养且遗传稳定的供体细胞2. 筛选到稳定表达半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的胚胎干细胞，并获得亚克隆3. 发现在胚胎早期发育过程中起关键作用的新的转录子生物学功能4. 筛选出适合于在核移植前处理供体细胞的药物5. 筛选并确立在体细胞核移植后重编程过程中可能起关键作用的蛋白6. 筛选出能在蛋白水平上特异性调控Oct4或Nanog的有价值的调节性蛋白。并筛选

24、出一系列受到Oct4或Nanog调控的下游基因7. 分析出可能对神经干细胞的分化具有影响的lipid rafts；理解Wnt信号通路在HGF和bFGF引起的神经干细胞分化中的作用，解释HGF或bFGF信号途径与Wnt途径的关系，并证明Wnt信号通路中一些配体以及关键分子在此过程中的作用。8. 完成囊胚、原肠胚和部分神经胚及胎儿组织的采集，建立少量组织的DNA芯片分析方法。9. 发表学术论文10-14篇。第四年1. 灵长类动物成纤维细胞培养方法的建立和优化2. 制备灵长类动物克隆胚胎并进行胚胎移植3. 印记的消除对灵长类动物克隆胚发育的影响4. 早期胚胎表观遗传网络的研究5. 对可能起关键作用蛋白质进行深入的功能研究，包括蛋白质翻译后修饰的研究，与其它蛋白相互作用的研究，及利用各种表达转染系统在体内、体外研究其功能。6. 研究和探讨受Oct4或Nanog 调控的基因在干细胞多能性方面的作用机制。7. HGF、bFGF诱导神经干细胞分化的时空关系：其对不同发育阶段的类胚体细胞激活不同的下游信号通路、导致产生不同的细胞类型。8. 进行一些决定神经干细胞分化的基因的筛选工作。9. 系统分析恒河猴神经系