单分子探测技术

1、3/16/20221单分子探测技术单分子探测技术 报报 告告 人：人： 韩韩 洁洁 w单分子探测技术产生的原因w单分子探测的主要基本技术w单分子荧光检测的物理基础w单分子荧光检测技术应用 主要内容主要内容单单分子探测技术的产生原因分子探测技术的产生原因 通常对大量分子集合体的观察测量只给出一个通常对大量分子集合体的观察测量只给出一个参数的整体平均值参数的整体平均值 , , 单分子水平的测量则完全单分子水平的测量则完全排除了这种平均效应；排除了这种平均效应；单分子体系的变化过程与时间密切相关单分子体系的变化过程与时间密切相关 。采用。采用分子集合体时不能观察到这种时间相关的行为；分子集合体时不能

2、观察到这种时间相关的行为；观察到未知领域中的新效应。观察到未知领域中的新效应。 单分子检测的基本技术（single molecules detection, SMDsingle molecules detection, SMD) ) 扫描探针显微技术扫描探针显微技术(SPM) 光镊技术光镊技术 荧光技术荧光技术单分子荧光检测的物理基础单分子荧光检测的物理基础 荧光寿命荧光寿命 = 1/(Kf +K ) 荧光量子产率荧光量子产率 =发射的光子数发射的光子数/ 吸收的光子数吸收的光子数 光漂白几率光漂白几率光漂白光漂白荧光分子在激发光的照射下荧光分子在激发光的照射下 ,经历多次受经历多次受激、退激

3、过程后激、退激过程后 ,往往造成分子内部结构往往造成分子内部结构发生不可逆的变化发生不可逆的变化 ,不能吸收更多的光子不能吸收更多的光子而进一步发射荧光。而进一步发射荧光。光漂白几率光漂白几率d = 1 / 分子在漂白前吸收的平均光子数分子在漂白前吸收的平均光子数提供了一种提供了一种“远距离操作远距离操作”的方法的方法. .在不在不丧失优越的空间分辨率的情况下对样品丧失优越的空间分辨率的情况下对样品扰动很小。扰动很小。荧光技术特点荧光技术特点单分子荧光特性量子跳跃特性量子跳跃特性取决于单分子的周围环境和猝灭途径取决于单分子的周围环境和猝灭途径荧光偏振特性荧光偏振特性单分子荧光分子具有唯一的固定

4、吸收和发射偶单分子荧光分子具有唯一的固定吸收和发射偶极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测量单极矩，因此在偏振激光的激发下，通过测量单个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以完全确个分子的吸收和荧光的偏振方向，可以完全确定单个荧光分子的空间取向。定单个荧光分子的空间取向。单个单个GFPGFP分子的荧光分子的荧光on-offon-off现象现象Off 态主要来源于单个态主要来源于单个GFP分子的光化学诱导的长寿命的暗态分子的光化学诱导的长寿命的暗态单分子荧光探测的必须条件单分子荧光探测的必须条件在被照射的体积中只有一个分子在被照射的体积中只有一个分子 与激光发生相互作用与激光发生相互作用 确保单分子的信

5、号大于背景干扰信号确保单分子的信号大于背景干扰信号 (有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质有效减少拉曼散射、瑞利散射及其杂质荧光所造成的干扰荧光所造成的干扰)难点：难点：杂散光背景比荧光信号大得多杂散光背景比荧光信号大得多 RayleighRayleigh散射光散射光光学器件的散射光光学器件的散射光溶液杂质的荧光溶液杂质的荧光溶液的溶液的RamanRaman散射光散射光光谱过滤光谱过滤减小灵敏体积减小灵敏体积时间门技术时间门技术杂散光杂散光减小方法减小方法LIF LIF 的基本原理的基本原理在激光的照射下在激光的照射下 ,分子吸收光子而被激发到某一分子吸收光子而被激发到某一激发态激发态 ,在退激

6、的过程中发射荧光。对于荧光量在退激的过程中发射荧光。对于荧光量子产率较大的分子子产率较大的分子 ,其激发态的寿命为其激发态的寿命为 ns量级量级 ,而分子通过激光束的时间为而分子通过激光束的时间为 ms量级量级 ,因此在连因此在连续或准连续激光的激发下续或准连续激光的激发下 ,一个分子在通过激光一个分子在通过激光束的过程中束的过程中 ,将被多次反复激发而发射出大量的将被多次反复激发而发射出大量的荧光光子，即所谓的荧光光子，即所谓的“光子爆发光子爆发”（photon burst)单个染料分子所能发出的荧光单个染料分子所能发出的荧光光子数目光子数目两个假定：两个假定：激光光束正好聚焦在探测灵敏区的

7、中间激光光束正好聚焦在探测灵敏区的中间 染料分子通过探测灵敏区的中心染料分子通过探测灵敏区的中心P:激光束的平均功率激光束的平均功率:聚焦半径聚焦半径:激光波长激光波长:光吸收截面光吸收截面v:样品的流速样品的流速h:普朗克常数普朗克常数 NA =EA/hc =0.76P/vhc 激光功率对荧光强度的影响曲线激光功率对荧光强度的影响曲线共聚焦显微镜原理共聚焦显微镜原理昆虫脑部双重染色昆虫脑部双重染色a. 传统的荧光显微影像传统的荧光显微影像b.共聚焦显微镜影像共聚焦显微镜影像单分子对荧光能量共振转移单分子对荧光能量共振转移(sp F R E T )原理原理：标记两个不同的荧光基团标记两个不同的

8、荧光基团,一个是供体。另一个一个是供体。另一个受体受体 。受体的吸收光谱与供体的发射光谱相重。受体的吸收光谱与供体的发射光谱相重叠叠 。由于。由于偶极偶极 -偶极相互作用偶极相互作用 ,能量从供体传递到能量从供体传递到受体。受体。 通过探测能量转移效率通过探测能量转移效率 ,可确定可确定两点间的距两点间的距离离 ,并且通过检测能量转移效率随时间的变化来推并且通过检测能量转移效率随时间的变化来推测构象的变化所引起的两点间距离的变化。测构象的变化所引起的两点间距离的变化。单对单对 - -体系标记的单个无抑体系标记的单个无抑制剂蛋白的能量转移过程制剂蛋白的能量转移过程展望展望 作为一门新兴边缘学科作为一门新兴边缘学科 , ,单分子科学展现出单分子科学展现出蓬勃的生机。蓬勃的生机。1.1.单分子实验方法还有待于进一步开拓与改进。单分子实验方法还有待于进一步开拓与改进。如荧光技术中时间匹配如荧光技术中时间匹配 ( (荧光漂白荧光漂白 ) )。2.2.单分子理论还有大量工作可做。单分子实验方单分子理论还有大量工作可做。单分子实验方法的一个共同特点是信息量大法的一个共同特点是信息量大, ,而