共振光散射技术原理及其定量基础

1、共振光散射技术原理及其定量基础光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。光散射与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产生散射光。光散射技术在物理化学、胶体化学和高分子化学研究中具有十分重要的地位，主要用于大分子的结构及分子量测定l,2，以及提供有关粒子大小、形状等方面的信息，但在以前的分析化学领域中，特别是荧光测定中则成为一种干扰源而严重影

2、响荧光分析的灵敏度，需采取措施加以避免和消除。当介质中粒子直径远大于入射光波长(0)时，产生的散射可看成是反射和折射：如果介质中粒子直径与入射光波长相近，便产生了丁达尔(Tyndall)散射;如果介质中粒子很小，如d200时，便产生以瑞利(Rayreigh)散射为主的分子散射。根据入射光和散射光波长的不同，光散射又可分为弹性散射、非弹性散射和准弹性散射。Rayreigh散射、浑浊介质Tyndall散射和透明介质的分子散射都是弹性散射;Raman散射和Bri1louin散射是非弹性散射;入射光频率和发射光频率仅有微小差别的是准弹性散射。在假设没有吸收的波长范围内，瑞利散射光遵守I-4的瑞利定律。

3、瑞利散射能为化学研究提供诸如分子形状和尺寸3、分子量4、旋转半径5以及反应过程的动态行为6,7等，但信号响应低和选择性差的缺点限制了瑞利散射技术在研究极稀溶液和复杂混合物中物质的浓度和结构信息方面的应用。但实际上所有的吸收过程都与光散射紧密相连，当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射，这种吸收一再散射过程称为共振瑞利散射或共振增强瑞利散射(Resonance Rayleigh scattering，RRs)8,9，现在较普遍的称之为共振光散射(Resonance light scattering，RLS)。由于共振瑞利散

4、射有极高的强度，所以使用普通的荧光分光光度计也能检测到，而不必使用昂贵的激光光源作为入射光。1993年美国著名化学家Pasternack等l0首次在普通的荧光分光光度计上用共振光散射技术研究了卟啉类化合物在核酸分子上的J型堆积，显示出该技术在研究生物大分子的识别、组装、超分子排列等方面独特的优势l1-14，激起了分析工作者的浓厚兴趣和广泛关注，得到了迅速发展，从而为共振瑞利散射技术的深入研究和广泛应用奠定了基础。共振光散射理论及其根据宏观波动理论，分子散射源于折光指数(m)的涨落，而折光指数可以分为实部和虚部两部分，即，m=n-ik，其中n是溶液的折光指数，k是吸光系数，在分子吸收带附近溶液的

5、折光指数与波长和摩尔吸光系数的关系与分子在整个波长范围的吸收有关，可用Kronig-Kramers方程15表示: (l)式中n0为纯溶剂的折光指数，c是溶液的物质的量浓度，0是真空中入射光和散射光波长，入是整个分子吸收带中的任意研究波长，()为所研究波长处分子的摩尔吸光系数。与n不同的是，构成折光指数(m)的吸光系数(k)仅与吸收带相关的分子量子跃迁有关，它与入。处的摩尔吸光系数()的关系为l5: (2)这样就得到表征体系光散射特征的瑞利比(Rayreigh ratio)，在与入射光成90º角处检测，瑞利比大小为15: (3)式中NA是Avogadro常数，%肠。和。k俗。分别是1.

6、0M溶液中表示折光指数实部和虚部的增量，q，是表示光散射增加的Cabannes因子。引人n和k，可得 (4)因此，如果人射光波长接近分子吸收带，则饥/。共O，即除折光指数的实部对光散射有贡献外，虚部也具有相当大的贡献，特别是吸收带强烈时贡献更大，将产生共振 Rayleigh光散射增强，增强与分子吸收带中电子跃迁有关。由于R=IRL班。，其中IRLs表示共振光散射强度，I。表示入射光强度，则: (5)由此式可知，在其它条件一定时，共振瑞利散射强度与溶液的物质的量浓度(C)成正比，这是共振光散射作为物质浓度测定方法的定量基础。由于共振光散射信号属于同步发光，所以可以根据同步发光方程理解其定量基础1

7、6:IsL=KebEex久x)Eem(从x+乙劝(6)或IsL=KebEe、(凡m一乙劝Eem(从m) (7)其中，Eex一给定激发波长处(从厂从m一乙劝激发函数，Eem一对应发射光波长处(从笼二从m一刁劝发射函数(从=m从x+乙劝，K一与仪器条件常数有关的常数，b一液池厚度，c一溶质的物质的量浓度。当乙入=Onlll时，即得共振光散射强度:I璐L=KebEex(从x)Eem(从x) (8)或IRsL=KebEex(凡m)Eem(从m)(9)即在条件一定时，共振光散射强度与散射粒子得浓度成正比。据此可用于散射粒子的定量测定。3蛋白质的测定蛋白质的测定方法很多，如最早的浊度法、凯氏定氮法，和目前

8、应用最广、操作较为简便的吸光光度法、荧光光度法，还有后来发展起来的高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。3.1 浊度法利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度相比而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法l6。该法操作简便、快速、试剂易购，为临床常规检查所用，但是由于所用试剂的浓度、滤光片的波氏及反应浓度没有标准化，因此结果的准确度和精密度较差。3.2 凯氏定氮法(Kjeldahl)该法是利用一般蛋白质含氮量平均在16%，可将测得的含氮量折算成样品中蛋白质的含量l7。凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果

9、往往偏高。3.3 吸光光度法测定蛋白质含量常用的吸光光度法包括经典的紫外光谱吸收法、双缩脲法、Lowry法、4-喹啉甲酸法、染料探针法和染料-金属配合物探针法等。3.3.1 紫外光谱吸收法蛋白质分子中所含的酪氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸残基的芳香结构对紫外光有吸收作用，其最大吸收峰在280nm附近，可用作蛋白质含量的定量测定18。本法操作简单、灵敏、快速、低浓度的盐类不干扰测定，但嘌呤、嘧啶等干扰严重，且不同种类蛋白质的上述氨基酸残基含量不同，其差异较大，这就决定了紫外吸收光谱法的局限性。3.3.2 双缩脲(Biuret)法双缩脲法l9,20是根据双缩脉在碱性硫酸铜溶液中，形成紫色络合物的现象发展

10、起来的。该法信号响应受蛋白质种类差异影响较小，缺点是灵敏度低，干扰较大，且操作复杂。3.3.3 劳里(Lowry)法Lowry法2l是至今蛋白质定量的最常用方法。该方法的线性范围宽，灵敏度好，但它基于酚试剂与蛋白质反应是非特效反应，抗干扰能力较差。3.3.4 4-喹啉甲酸法(简称BCA法) BCA法是对劳里法进行了改良，用4-喹啉甲酸代替了Folin-Ciocalten试剂。与Lowry法相比，BCA以法的常规测定程序与Lowry法相近，但BCA以法抗试剂干扰的能力和工作试剂的稳定性较好。此法测定不同蛋白质时，测定值变化差别较小，但最大的缺点是受葡萄糖的干扰较大22-29。3.3.5 染料结合

11、法染料结合法在蛋白质分析中应用最为广泛，现已应用于临床医学及生命科学的研究中。它基于在溶液pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质键亚胺和N端氨基质子化成阳离子，若有阴离子染料存在时，蛋白质易于与染料结合成沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借助染料颜色的减退或变化的程度来测定蛋白质的含量。染料结合法在试剂的稳定性、实验操作的简便性、精密度及抗干扰能力等方面都优于Lowry法，灵敏度也比较高。最早用于测定蛋白质的染料是偶氮类试剂30-50，随后扩展到三苯甲烷类试剂36-50、羟基蒽酮类化合物57,58、酸性咕吨染料59-63等。此外，近年来还发展了一些新的微量蛋白质定量法。如：蛋白质-银结合法64、胶体金

12、、把测定微量蛋白质65,66、锌试剂显色法67等。3.3.6 染料-金属配合物探针法金属离子-染料结合法68-70是近几年来兴起的一种新方法。其机理为金属离子与含有经基或拨基的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进入杂化轨道，形成稳定的配合体系，在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时互相极化产生静电作用而合成新的大分子团;另外，大分子内部易形成氢键作用，蛋白质分子中的芳香氨基酸残基与有机染料分子中的芳香结构都具有疏水作用而相互靠近，从而改变了原体系的光谱性能，进而能定量测定蛋白质的含量。表1 几种方法的比较Table 1 The comparison of some protei

13、n assays方法灵敏度干扰蛋白质间差异双缩脉法低多小Lowry法较高多中等BCA法高少小染料探针法高较少中等配合物探针法高少小3.4荧光法荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法，常用的有自身荧光法、荧光探针法、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析法。3.4.1 自身荧光法蛋白质中存在着Tyr，Trp，Phe残基，能够吸收270300nm的紫外光而发出紫外荧光71,72。用荧光法对蛋白质进行定量比紫外分光光度法灵敏，且没有核酸的干扰，来自其它小分子化合物的干扰也相对较小。但其缺陷也是显而易见的，不同蛋白质中荧光氨基酸残基的含量可能会有很大的差别，因而定量时要选择同一种蛋白质作为标准。3.

14、4.2 荧光探针法与光度法类似，蛋白质在与某些有机荧光试剂结合后，能引起溶液荧光强度的变化(增强或碎灭)，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，据此可用于蛋白质含量的测定。该法中可分为有机荧光探针法和稀土荧光探针法。最常用的稀土荧光探针是铕()，铽()，Tb()及稀土鳌合物等73-75。常用的有机荧光探针有2-对甲胺萘-6-磺酸(2,6-TNS)76，1-苯胺基蔡-8-磺酸(ANS)77，吖啶橙(ADO)78，血管黄素79，曙红Y80,81，耐而红82，赤鲜红(EB)83，络天青84-86，四磺基铝酞箐(AlS4PC)87,88，2-甲基-5-(2,3,4-三甲氧基苯酚)环庚三烯酮(MTPT

15、)89，3-(4-羧基苯甲酰基)喹咛-2-羧基乙酰(CBQCA)90等。3.4.3 时间分辨荧光法时间分辨荧光光谱(TRFS)是依据待测组分荧光衰减特性的差异而进行选择性测定，可以消除瑞利和拉曼散射的干扰，又可以根据荧光寿命的差异对荧光光谱重叠组分进行测定，为复杂体系的荧光测量提供了选择性基础91。时间分辨-荧光免疫分析以具有较长荧光寿命的荧光基团作为免疫标记，利用时间分辨荧光测量技术进行测定。一方面可以在荧光分子定量中获得高灵敏度，另一方面可以通过时间分辨技术使选择性可以得到改善，这样就可以定性和定量分析微量蛋白质。荧光法测定蛋白质含量通常比分光光度法更灵敏，其测定条件更接近生命体的生理环境

16、，但它仅适用于具有荧光的体系，并且一些荧光物质有毒，价格比较昂贵，因而使方法的使用范围受到限制。3.4.4 高效液相色谱法用高效液相色谱法(HPLC)来分析蛋白质是一种近年来发展较快新型分析方法。HPLC分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好，分离效率高，检测灵敏度高。根据分离机理、蛋白质的HPLC可以分成尺寸排阻色谱(SEC)92、反相高效液相色谱(RP-HPLC)和凝胶渗透色谱(GPC)三大类93。由于蛋白质往往容易吸附在ODS柱中，这就使得测定结果的相关性较差。所以，在很多情况下，应考虑采用复合分析方法，将用于蛋白质分析的HPLC法和其它分析方法结合起来使用，这将更有利于蛋白质的分离94。

17、该法操作复杂，仪器昂贵，从而使受限制。3.4.5 毛细管电泳毛细管电泳(CE)是近十几年来发展起来的一种分离分析技术，兼有普通电泳和色谱的双重优点，以其高灵敏度、高分辨率、快速、低成本、信息量大和易于自动化等特点而受生物化学和临床药物等领域的专业人士的青睐95-97。该法的缺点是重现性较差，使定量分析结果准确度较差。3.5 共振光散射法如前已述，共振光散射技术(RLS)是一种新兴的测定生物大分子的简便、快捷、灵敏方法。目前测定蛋白质的共振光散射方法所使用的试剂主要有：酸性三苯甲烷类，如四碘酚磺酞(TIPSP)98，铬天青(CAS)99,100，酸性绿25(AG25)101;酸性咕吨染料，如溴邻

18、苯三酚红(BPR)l02，邻笨三酚红(PR)103;酸性偶氮染料，如变色酸单偶氮染料l04，酸性铬蓝K(ACBK)105，偶氮肿(AA)106，偶氮磺(S)107，曲利本蓝(TB)108，4-偶氮变色酸苯基荧光酮(ACPF)109，金橙G110;卟啉类试剂111,112;纳米粒子化合物113;杂多酸114;表面活性剂1l5等。6本学位论文的主要创新点本论文工作的主要创新点如下:1.荧光酮类化合物是一种常见的分析试剂。然而，至今很少见到有报道关于使用荧光酮类化合物作为共振光散射探针测定蛋白质。我们首次研究荧光酮类化合物与蛋白质之间减弱的共振光散射研究，并且将其应用与人血清蛋白的总量测定方面，结果

19、与传统方法相符合。另外，本文还首次用共振光散射技术研究了-环糊精-十二烷基磺酸钠与蛋白质之间的作用及其应用。2.诺氟沙星是第三代哇诺酮类合成抗菌药，对革兰阴性菌、金黄色葡萄球菌有很强的杀菌作用，已成为临床基本用药。我们首次用RLS技术研究诺氟沙星与核酸之间的相互作用利用诺氟沙星与核酸之间的反应，建立了一种操作简单、选择性好、灵敏性高的新颖方法。氧氟沙星是第3代哇诺酮抗生素代表药物，为DNA螺旋酶抑制剂，抗菌谱广，尤以对革兰阴性杆菌作用强，临床上用于治疗革兰阴性菌及阳性菌引起的泌尿道、呼吸道、耳、鼻、喉及浅表化脓性疾病等多种感染。本文用共振光散射技术及其它方法对氧氟沙星与核酸反应机理作一些探讨，这对了解药物在体内的输送、代谢过程非常重要。本文还建立了一种新颖的、非常灵敏、操作简单及选择性好的测定氧氟沙星的新方法。用该方法测定人血液中微量的氧氟沙星含量，获得了满意的结果。3.希夫碱与核酸之间的作用研究一直备