地衣共生菌藻及分离与培养

1、地衣共生菌藻的分离与培养地衣是一种真菌，由地衣共生菌和一种藻类或蓝细菌（蓝藻）的共生而形成的联合体，属“二元”生物体。在这个二元共生联合体中，真菌菌丝缠绕大量的光合细胞。在上述地衣的定义我们可以提出这样的一个问题：地衣是否可分为单个生物体？地衣生物学研究的许多方面均涉及到这些不同有机组织的相互作用。对于共生体的分离和培养研究，为科学家对于地衣共生关系本质的探讨提供了迷人的前景。该研究的中心问题是地衣光合共生物以及地衣共生菌的培养，这也是解决地衣生理、形态、发育和分子生物学等方面研究的根本问题。 地衣共生体的培养曾经被认为难以进行，这主要是因为这是一项很耗时的工作，而且共生体的培养是否成功需要长

2、期的技术探索。然而，Ahmadjian（1967b）突破性的研究引起了许多地衣学者对共生菌藻培养的兴趣。在过去的二三十年间，关于地衣共生菌藻的研究和地衣的人工重建已取得了相当的成就，如图一所示，地衣共生菌藻培养可以通过各种不同的方法而实现。地衣共生体的培养很难，即使用具富营养的培养基。主要是因为共生菌的生长远远快于共生藻或蓝细菌。此外，霉菌、酵母菌和细菌等的污染也是很重要的因素。因此在所有的操作过程中要进行无菌操作以防污染。本章的目的在于讲述从地衣中分离出共生菌藻并进行培养的方案。子方案I讲述了地衣共生菌培养的各种方法。子方案II讲述了地衣共生藻培养的各种技术。这些培养技术已有报道，但我们在此

3、研究的基础上又添加了一些新的内容。关于共生体的分离技术已有Ahmadjian（1967a,b）和Galum（1988）全面的描述了。子方案I 共生菌的培养注意：除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上或无菌的条件下进行。所有的仪器在用之前都应高压灭菌（1520分钟，121，1 atm）或干热灭菌（30分钟，180）。一、仪器与材料仪器：显微镜、解剖镜、相差显微镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生机、离心机、超净工作台或无菌工作室。真菌来源：我们建议所用的地衣应为野外新采集的而且在一周内利用。然而地衣也可以在干燥状态下保存几周，或在冰箱内存放几年（Yoshimura et al. 1990

4、)。共生菌可以从子囊孢子、分生孢子、裂芽、粉芽和菌体碎片中分离出来（Ahmadjian 1993）。用来实验室培养最常见的共生菌分离方法是：孢子释放法，主要是子囊孢子。获得共生菌藻的另一个方法是解剖菌体切片，这样会形成大量较纯的共生菌，在第二章我们将详细介绍从菌体碎片中获得共生菌和藻的方法。保存在Akita profectue University和Kochigakuen college的培养真菌可见表1。（P713）。真菌培养基： Ahmadjian（1993）和Pyatt（1973）建议用来孢子收集和萌发的培养基应含营养量低。可在15黑暗条件下，采用含水4%的琼脂培养基以取得了较好的效果。

5、这类共生菌的培养基如下：WA4培养基含4%蒸馏水的琼脂培养基琼脂 4克 蒸馏水补足100ml MY培养基麦芽酵母提取物培养基（ahmadjian 1967 a）麦芽提取物 20克 酵母提取物 2克琼脂 20克 蒸馏水 蒸馏水补足1000mlLB培养基Lilly and Barnett s培养基（Lilly和Barnett 1951） 葡萄糖 10.0克 天冬酰胺酸（Asparagine) 2.0克KH2PO4 1.0克 MgSO47H2O 0.5克Fe（NO3)39H2O 0.2 mg ZnSO47H2O 0.2mgMnSO44H2O 0.1mg 维生素B1（Thiamine) 0.1mg维生

6、素H（Biotin) 5ug 蒸馏水补足 100ml可以在以上组分上加入1520g的琼脂，并补足 1000ml，并制成固体培养基。LBG 培养基Lilly and BarnettsGelrite 培养基LB培养基中以1%的w/v Gelrite 代替琼脂。注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前，应将所有培养基进行灭菌。二、实验步骤 （一）通过孢子分离出共生菌孢子释放： 1.把野外采集的地衣体洗净，放置几天使其于周围环境达到水分平衡。也可以将材料清洗和冷冻，在用之前平衡几个小时。2.从地衣体上取下子囊盘或子囊壳，并将其在放有蒸馏水的培养皿中浸泡4小时或在流动水中清洗。通过挤压

7、去除多余的水分。3.将其用凡士林固定在皮氏皿底部，然后用含水4%的琼脂培养基盖在培养皿上部，将培养基放在培养皿的上面盖上，并防止琼脂污染。4.确保琼脂在孢子的释放范围之内（大约510mm），释放的孢子会单个或成团的附着的琼脂的表面。如果要进行单孢子分离可以通过减少孢子的释放时间或增加子囊果同琼脂之间的距离；否则会得到的是孢子团。在适当的间隔（依据于释放时间，通常一天）多次的旋转琼脂层。另外在潮湿的环境中也可以释放到玻璃片上或无菌的薄膜上，然后用蒸馏水将孢子冲下，立即转移到培养基上。5.用超薄膜将皮氏皿封口，在培养箱中进行培养，条件为无光、15。6.为了检验孢子萌发情况，可以在相差显微镜下，观察

8、孢子的释放情况。将释放的孢子转移到含有琼脂培养基的玻片上进行观察。保持皮氏培养皿玻片的潮湿，并连续观察。可以在水中或通过染色法（lactic-glycerol-cotton blue）观察孢子的萌发和菌丝体的生长情况。孢子萌发和菌丝体生长：有些地衣的孢子会在散出后的一天内萌发。萌发后，将含有孢子的琼脂小块切下并转移到含有营养培养基的皮氏培养皿或试管中。最常用的培养基为麦芽酵母提取物培养基MY培养基和LB培养基。（二) 从地衣体中分离出共生菌。由于有些地衣不产生子囊盘或成熟孢子，或者孢子萌发率低，这时候分离共生菌可用另外一个材料来源，如分生孢子（Vobis 1997）或粉芽（Honegger a

9、nd Bartnicki-Garcia1991；Hovegger et al. 1993)。由于裂芽经常被一些附生的微生物所污染，故不常用来分离共生菌。Yamamoto et al（1985）已经列出了采用地衣碎片分离出共生菌的方法。这可见于第二章。1.用消毒的刮胡刀将新鲜的地衣切成薄片，然后存放于不含营养仅含水的小试管中或放在15环境下的潮湿的滤纸片上。然后将冲洗后的地衣体碎片在研钵中磨碎并加水混匀成悬浮液。经过滤后的滤液再经过第二次过滤。从第二次过滤的滤纸上取出少部分接种至斜面培养基上。新的髓状菌丝通常会在二三周后延长。采用无菌技术切取一部分新长出的菌丝，转移到试管培养基上。我们发现这种方

10、法对于获的鹿蕊（Cladia rangiferina）和大叶梅（Paramotrema tinctorum）的共生菌很适用。2.应当对此实验进行多次重复，以保证生长的真菌最有可能为共生菌而不是生长于地衣体表面或内部的其他真菌。（三）培养共生菌的保存共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。但是，最好在两三个月内按如下步骤进行一次继代培养。利用解剖刀将培养的共生菌分为几部分（通常为5mg）。将各个部分放在皮氏培养皿中的MY培养基或LB培养基中，在15无光条件下培养23个月。每2至3个月重复一次该步骤。通常共生菌在1520时表现出最大生长率。在共生菌的培养中，培养基的pH值对群体生长有着重要的影响

11、。每种共生菌均有其最适生长pH值，通常pH范围为56，太高或太低的pH均会阻碍其生长。在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍具有活性。三、注释1.孢子的释放 对于许多地衣来说，在将子囊盘放在皮氏培养皿一天之内就可观察到孢子释放。然而，有些地衣却只有在二三周后才可观察到孢子释放表2（P18）。将子囊盘放在皮氏培养皿后，孢子第一次释放时间变化很大。孢子释放的时间主要取决于地衣种类以及子囊盘采集时发育和代谢状况，以及采集后的地衣体处理和子囊果的年龄。同样，孢子释放的数目和释放的持续时间也有很大的变化也取决以上因素。将其浸放水中约15分钟至24小时，然后吸干并放

12、在潮湿空气中（90%RH）慢慢变干，可以获得最大孢子释放量。许多地衣，如Porpidia albocaulescents， graphis cervina（Ahmadjian 1993），孢子在释放后很容易分散开来落在琼脂表面。这种情况下，很容易进行单孢子培养。然而在毛根石耳（Umbiliacaria vellea)和其他一些种类中，孢子却形成一个8孢或少于8孢的孢子团，在这些种类中单孢子分离就有些难度。Ahmadjian（1993）提出了孢子进一步分离的一些方法（如以下所要提到的微量吸管吸取法）。Yamamoto et al.（1998)发现许多地衣的孢子释放情况受到采集季节、存放温度和存放

13、时间的影响。通过对一些种类的实验可知，它们的孢子形成或多或少有着内部的节奏。对一些温带地衣来说，春夏季是孢子释放的最佳季节。但是，在加拿大采集的石耳属（Umbilicaria)孢子却在夏季很容易萌发。2.孢子萌发据Pyatt（1968）报道，有些孢子在释放后的24小时内很快就会萌发，而另外一些则需要花费45天才能萌发。对于大多数地衣来说，孢子在释放几天后就会萌发。在我们实验中，孢子萌发期约为散发后121天（见表2)。有些孢子也许在释放时就已萌发。Lawarey （1984）报道Cetraria ciliris的孢子在释放后的六周后才萌发。Roussard（1969）和MathyHoder（19

14、78）称许多孢子甚至在子囊内就萌发了。通常，壳状地衣的单细胞孢子比二孢子或多孢子萌发的要快。叶状和枝状地衣的孢子比壳状地衣的孢子萌发的要慢。有多核的砖壁型多孢子或单孢子则需更长时间萌发。孢子的萌发受到培养基组成、培养基初始pH值和培养温度的影响。实验中大部分种类的孢子均在pH为6、温度为15的普通琼脂培养基上萌发。Letharia的孢子不能在琼脂培养基上萌发，但可以在Gelrite 培养基上萌发。一些种类的孢子不能在麦芽酵母提取的培养基上萌发。许多Peltigera种类的孢子可以在添加了树脂的培养基上萌发，因为树脂可以吸收抑制孢子萌发的石炭酸（phenols）。3.培养基的改进通过对氨基酸或其

15、他含氮类物质形式存在的氮素利用的研究，所得出的结果各异，因而没有一个统一的结论。添加大部分氨基酸会促进共生菌的生长。只有半胱氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，不会维持其生长。大部分己糖碳源也会促进其生长。麦芽糖、甘露糖和乳糖也可以促进其生长，而柠檬酸盐、醋酸盐、红藓醇（erythritol）、三糖类则是不理想的碳源（Ahmadjian 1967b；Hale 1983）。通过改变和改进碳源和氮源均可改变共生菌丝的形态和生理特点。各种地衣共生菌对VB1，和维生素H均有一定需求，有些仅对其中一种有需求。4.过滤膜的应用共生菌丝可直接接种到琼脂培养基或滤膜上培养。过滤膜可用纤维素、醋酸和硝酸纤维脂类、

16、玻璃纤维制成（Oliver et al. 1989, Honegger and Kutasi 1990）。采用滤膜的优点在于它可以容易的转移到新培养基上。5.液体培养基的应用若采用液体培养基进行浸润培养，需要经常更换培养基（Honegger and Kutasi 1990, Honegger and Kutasi et al. 1993）。由于大部分分离单位易于形成较硬的、只有边缘生长的生长不旺盛菌落，因此最好将材料定期用匀浆机研磨成均一的物质（Honegger and Kutasi 1990, Armaleo 1991）。由于不同的种类在其营养需求上有各自不同的特点，因此，很难得到共生菌培养

17、的普通培养基（Bubrick 1988）。6.pH值和光的影响尽管培养基的pH值和光对共生菌形态和生理的影响很少受到注意，但其影响却是很重要的。由于地衣共生菌是一种异养生物，故也许会被认为对不同的辐射和光照时间没有反应。然而，光对非地衣真菌繁殖的影响比对其生长的影响更大。 子方案 II 共生藻的培养早期的学者将地衣成薄片放在有光并且潮湿的房间里，使潮湿和光照促使藻共生体的生长，并分离出共生体组织（Ahmadjian 1967b）。这是一种获得光合藻最简单的方法。Nakano（1987）改进了该方法，并做了详细的叙述。Nakano和他的合作者已经从日本地衣中获得了许多共生藻（Nakano 198

18、8,Takeshita et al. 1989）。注意：除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上进行或在无菌条件下进行。用之前所有仪器均应高压灭菌或干热灭菌。一、实验材料：显微镜、解剖镜、高压灭菌锅、培养箱、超声波发生器、离心机、超净工作台或无菌室、毛细管、微量吸管。特殊微量吸管的制作：（1）将一个内径为45mm，长为 20cm 玻璃管的中央加热，从两端向外拉伸使其从中间断开（图3）。（2）在吸管较宽的一端塞一个棉塞，并联接一个长的橡皮管。（3）将微量吸管用铝箔包住灭菌。在用之前，在超净工作台上加热较窄的一端，用镊子将其拉成一个毛细管。拉成的毛细管直径应为典型藻细胞直径（约50-75m

19、）的几倍。 二、共生藻的培养基：大多数藻类在培养基上易于生长。只有少数藻类对有机碳源或有机氮源有绝对的需求，一些绿藻在加有葡萄糖或蛋白胨的培养基上生长尤其快。培养共生藻的培养基如下；BBM培养基Bolds Basal Medium（Deason bold 1960；Bischoff Bold 1963）NaNO3 250mg KH2PO4 175mg K2HPO4 75mg MgSO4·7H2O 75mgCaCl2·2H2O 25mg NaCl 25 mEDTA 50mg KOH 31mg FeSO4·7H2O 4.98mg H3BO3 11.42mg ZnSO4

20、·7H2O 8.82mg MnCl2 1.44mgMoO3 0.71mg CuSO4·5H2O 1.57 mgCo（NO3)2·6H2O 0.49mg 加蒸馏水补足1000ml 可以在以上组份中加入1520g琼脂，并蒸馏水补足1L制成固体培养基。3×N BBM培养基（Brown Bold 1964）是由BBM改进的培养基，只是比BBM多了3倍的氮素。 同上一样，只是NaNO3为750mg。如制成固体培养基，需在以上配方中加入1520g琼脂，并蒸馏水补充1L。Trebouxia 有机营养培养基（Ahmadjian 1967a） 1×N BBM 9

21、70ml 葡萄糖 20 g 蛋白胨 10g以上组分中加入1520g琼脂，加蒸馏水补足1000ml，可制成 固体培养基。MDM培养基：用以培养蓝细菌，从而代替BBM培养基（Watanabe 1960）KNO31g MgSO4·7H2O 250mgK2HPO4 250mg NaCl 100mgCaCl2·2H2O 10mg 铁溶液 1mlA5溶液 1ml 加1520g琼脂，蒸馏水补足1000ml 铁溶液制备：FeSO4 1g、蒸馏水500ml、浓硫酸 2滴 A5溶液制备：H3BO3 286mg、MnSO4·7H2O 250mg、 ZnSO422.2mg、CuSO4&#

22、183;5H2O7.9mg、Na2MoO4 2.1mg、蒸馏水 100ml 其他类培养基的报道，主要有：Kratz and Myers（1955），Stanier et al.（1971），Starr （1980），Nichol（1973），Allen（1968；1973），Archibald（1975；1977），Carr et al.（1973）也提出了其他的培养基。注意：在将培养基使用或倒入试管（5ml）或皮氏培养皿（5ml厚)之前应进行消毒。三、培养步骤：（一）前处理操作：1地衣体的清洗对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约12，然后放在自来水中浸泡510分钟，用画笔刷在流动的

23、自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将其放入装有12 ml的无菌水和一滴吐温20（Tween20）的小试管中。超声波粉碎约3分钟。离心（2000rpm）去除地衣体表面的附属物。2地衣体匀浆液的制备除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上进行，或无菌条件下操作。所有仪器均应高压灭菌（1520min，121，1atm）或干热灭菌（30min，180）。用酸或清洁剂清洗脏的玻片，然后用蒸馏水冲洗。大型地衣（枝状或叶状）：（1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。（2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。（3）在显微镜下，取下

24、藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。（4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。几位学者发明了许多地衣冲洗的方法和一些最好设备的建议，如Ahmadjian（196

25、7a）发明的木板和Yoshimura et al.（1993）的小冲洗器、杯子和过滤器。对于蓝细菌可采用冷冻切片机产生的切片（小于40m的厚度）进行培养。（二）共生藻的分离：1在皮氏培养皿的固体琼脂培养基上滴几滴含有共生菌藻的悬浊液。绿藻要用1×N的NBBM培养基而蓝细菌则用MDM 培养基。另外，也可以将含有共生菌藻的悬浊液喷到皮氏培养皿的琼脂培养基上。2在15的培养箱中培养15天。通常培养应保持在1520，光强为1027molm-2s-1（PPED，photosynthesis photon flux density）的条件下。培养基最初应放于低光强下。3大约一月后（取决于共生藻种

26、类），琼脂培养基上就会出现较少的共生藻群。如果之前地衣冲洗较彻底，培养基上应生长出真正的共生藻。4确定分离的藻类是真正的共生藻有重要意义。一些丝质藻的污染可能源于渗入碎片中菌体组织的单细胞。单细胞藻类污染可能源于细胞壁上留下的菌丝体片段。（三）无菌培养群体的获得：生长在培养基上的藻类，有许多可能受到污染。为了获得无菌共生藻的培养群体可采用以下方法。1直接法：可以在体视显微镜下将未受污染的群体选出来，并移植到适宜的固体培养基上。在试管或皮氏培养皿中的Trebouxia有机营养培养基（Ahmadjian 1967a）用于绿藻，含有1%葡萄糖的MDM培养基用于蓝细菌（Watanabe 1960）。如

27、果未受污染就可获得无菌培养群体。然而，共生藻群却常常受到细菌、共生菌以及其它生物的污染。此时有必要用喷雾法和微量吸管吸法获得真正无菌群体。2喷雾法：该技术由Wiedemen et al.（1964）提出，很适用于绿藻单细胞的分离。对于单细胞绿藻或无菌群体获得很有用。（无细菌、酵母菌污染，也无附着在共生藻上的共生菌污染（见图4）。具体步骤为：（1）从单细胞中获得群体，然后从生长在琼脂上的群体中选择污染低（或未污染）的群体，并转移到试管中1×N BBM的斜面培养基上，培养几周。（2）在10ml的离心管中加入1ml 蒸馏水和一滴Tween-20，将共生藻移入。（3）超声波粉碎。这样会使共生

28、藻群同附着在其细胞壁表面上的细菌和共生菌污染物分开。（4）将混合物离心可以将共生藻同其他物质分离。（5）移去上清液，在离心剩下的共生藻细胞中加入1ml无菌水和Tween，重复以上操作约十次。（6）在离心管底部插入一个毛细管，并保持直立。（7）通过毛细管的小开口引出压缩空气，压缩空气穿过伸出离心管的毛细管。（8）藻培养液就会被冲出毛细管形成喷雾。（9）快速将含有培养基（通常为Trebouxia有机培养基）的皮氏皿通过喷雾，培养皿上就会附着一层藻细胞的悬浊液。（10）一周或二周后，将未污染的藻群体移到合适的培养基上。3微量吸管吸法：尽管该法不能用来分离长的丝质藻，但却是分离绿藻可靠的方法。 （1）

29、在每一个有五孔的载玻片滴加一滴无菌水或无菌培养基。从营养培养基上取下生长的藻类，将其放入玻片的第一个孔中。如果藻群体成团状，可以通过超声波将其分开。（2）在体视显微镜下，用微量吸管吸取510个藻细胞。（3）挤压微量吸管胶头，将所吸细胞放入第二个孔中。（4）重复以上操作五次以上。微管的尖端应进行蒸汽灭菌，以防止污染。有时将藻细胞放入新的无菌水时会漂浮在表面，这样就会很难吸取藻细胞。一般来说，大部分细胞会几分钟后沉入水中。（5）如果污染十分严重，那就需要采用更多的蒸馏水或无菌培养基重复以上步骤。（6）在最后清洗之后，挑取单藻细胞转移到新的培养基上（一般转移1050个细胞)。（7）用于绿藻培养的Tr

30、ebouxia有机营养和用于蓝细菌培养的含有葡萄糖的MDM培养基，可以检验培养是否成功。如果受到细菌或酵母菌的污染，它们会在营养丰富的培养基上快速的生长。从蓝细菌的胶状外鞘上去除细菌十分难，然而它们可以与藻类协同生长，并不影响共生藻的生长。尽管在实验室中还没成功地获得较纯的蓝细菌群体，也许可以通过显微操作做到这一点。平均从一种地衣中应分离出15个单细胞。4切片法：仅用以上介绍的方法很难获得无菌的丝状绿藻，如Trentepohlia。切片技术会有利于获得这些丝状绿藻。（）采用消毒的解剖刀从藻的顶端切下新长成的藻丝，然后转移到新的培养基上。 （）采用Yamamoto的方法（见第二章)，在第二次过滤

31、后，放在解剖镜下挑取淡绿色部分，然后将其转移到有固体培养基或完全琼脂的试管中。（）将装有斜面培养基的试管（约50个）保存几周，然后去除任何污染的试管。培养试管的污染取决于地衣体部位和状况及地衣的种类。（）在未污染的试管中，共生体（光合藻和共生菌）大约在培养的四周后长出来。采用一些附加的处理方法（喷雾法或微量吸管吸法）可以将共生藻进一步分离，以获得源于单细胞的纯基因上藻群。5离心方法：Richardson（1971)发表的离心技术的方案如下所述。（）将地衣匀浆获得的悬浊液（子方案一）离心（100400g，10min）。通常，在低速离心（100200g，10min）后大部分小的共生藻会存在于上清液

32、中。对较大的共生藻必须采用不同搭配的速度和时间。可以采用低的离心速度（100g）去除较大片的地衣体或组织块，采用较高的速度（400g）从细胞碎片和残物中分离出完整的细胞。（）将样品在离心前通过网孔为1030m的筛子过滤或通过其他较大孔的过滤器，以除去较大的残片 （Bubrick1988）。（四）光合共生藻培养物的保存在低光照的条件下，共生藻可以培养很长一段时间 （约年) 。然而，我们认为最好每23个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生长温度为1520。然而，在选择培养条件时应考虑地衣自然生长的温度。其生长的最佳pH范围是47。其生长的最佳光照范围为1627molm-2s-1（PPFD）（Ah

33、madjian 1967a,b）。有色地衣的Trebouxia对高辐射敏感，而无色地衣的Trebouxia表皮具有耐光性。（）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部分（约5mm2），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿中培养23个月。（2) 每23个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。四、评述一些Trebouxia种的地衣在光强大于11molm-2s-1（Ahmadjian，1967a）下培养时会失色。我们认为在大约5molm-2s-1的光强下对Trebouxia培养，可以将该种保存很长时间。然而，作为分类

34、观察，Trebouxia必须在低于22，33molm-2s-1的光照条件下，光周期为12h，培养基为3×N BBM培养基的条件下进行培养。五、需要解答的问题1.子囊孢子不萌发：在没有合适共藻的时候，子囊孢子（如Peltigerales）有可能萌发，但却不能生长。这种情况下，共生藻的提取物有可能会促进孢子的萌发。在琼脂中添加完整的共生藻细胞也许会刺激共生菌的生长。可参考第三章。Pyatt （1973)、Ahmadjian（1993）和Yamamoto et al.（1998）已经对各种条件对地衣孢子的萌发的影响作了很好的研究。孢子的萌发会受到许多环境因素的影响。这些因素包括采收季节（P

35、yatt 1969， Ostrofsky Denison，1980）、培养湿度（Garrett，1971）、培养基pH值（Pyatt 1968，Chismas 1980，OstrofskyDenison 1980）、培养温度（Ostrofsky Denison 1980）、光周期（Pyatt 1968）、盐碱度（Rmakaer 1978）、自然提取物（Ostrofsky Denison 1980）、葡萄糖是否存在（Belandria et al. 1989）、地衣次生代谢产物（Whiton Larrey 1982，1984）、空气污染（Pyatt 1969， belandria et al.

36、1989）、重金属（Pyatt1 976）、低氧（Kofler 1970）和树皮成分（Ostrofsky and Denison 1980）等。2.污染：可以通过紫外线（可以损害细菌但不损害藻细胞）或抗生素去除附着在蓝细菌胶状鞘上的细菌。在培养时要防止小虫吃共生藻或共生菌，可用乙烯材料的盖子防止昆虫的破坏。第二章 地衣体碎片的培养与地衣的重分化自古以来，地衣就在全世界范围内广泛的用于医药、染料、香料、食品和饮料。在近二三十年来，已经从地衣中分离出许多活性物质。然而，对地衣大量的采集以用于工业生产，会导致地衣物种的灭绝。所以，地衣若要应用于工业，必须进行人共培养。通过孢子获得地衣共生菌是最主要的

37、方法。然而，这种方法有着许多缺点（Ahmadjian 1993，可见于第一章）。如子囊盘也许不会产生孢子，孢子也许不会萌发，而且有许多地衣不产生子囊盘。在实验室，我们已成功的分离培养和保存了400多种的地衣共生菌藻。自从Schwender（1868）提出地衣为菌藻共生体以来，对许多地衣学者来说，通过分离的地衣共生体进行地衣重建有一定的挑战性。很少的学者可以做到这一点，通常是不能做到无菌操作（可见于Ahmadjian 1973a）。大多数情况下，纯的共生菌群体培养并不适合用于满足研究次生代谢物的生理实验或工业生产的大量需求，这是因为培养共生菌所产生的次生代谢产物同完整地衣所产生的总是有一定的不同

38、。培养共生菌用于工业生产的另一个问题是其生长的速度很缓慢。另外，利用无菌分离的共生菌藻进行地衣的人工重建是一项非常难和相当费时的工作。 1985年我们提出了利用地衣碎片进行组织培养的技术（Yamamoto et al.，1985）。当我们实践时却发现培养的地衣碎片会受到污染。据Ahmajian在地衣中所称，地衣碎片的培养总会被其上所附的微生物所污染（Ahmadjian，1973b）。但我们认为，通过仔细的挑选较小的地衣碎片（几百微米），是可以减少污染的。1990年，Kon等人和Yoshimura 等人分别报道了在实验室中微地衣体的重分化。他们成功地在琼脂培养基上对地衣碎片进行培养并使几个松萝属

39、（Usnea）的种在无菌的条件下重分化。之后，Yoshimura和Yamamoto （1991) 成功地在培养皿中使一些蓝细菌地衣体重分化。如地卷属（Peltigera）的一些种。总之，我们用地衣碎片培养完成了5个属（Peltigera、Lobaria、Cladonia、Usnea）的重分化。在该章，我们将对利用地衣碎片的实验室培养以获得地衣体的方法进行祥述。另外，该方法也可作为无菌地衣共生菌藻群体的获得。该书的其他章（1和3章）已涉及这方法。虽然，利用地衣碎片获得重分化地衣体的方法并不能克服生长速度慢的问题，该法却比通过分离的地衣共体来进行地衣重建快的多。分离方案可见图1 地衣碎片培养方法（

40、地衣的组织培养）。一、实验材料注意：除了每一个清洗步骤，所有的操作都应在超净工作台上进行，或无菌条件下操作。所有仪器在用之前均应高压灭菌（1520min，121，1atm）或干热灭菌（180，30min）。1实验仪器：高压灭菌器、竹棍（长为15cm）、超净工作台、培养箱、尼龙筛（筛孔为150500m）、解剖镜2地衣材料：标本应为新采集未足1周的或采后1周内放在纸带中-25以下冷冻的。冷冻的标本在存储一年多后仍能用于培养。3培养基：MY 培养基（Molt/Yeast extract medium，Ahmadjian，1961） 麦芽抽提液 20g酵母抽提液 2g琼脂 20g加蒸馏水补足1000m

41、l LB培养基（LillyBarnett medium，Lilly and Barnett，1951） 葡萄糖 10.0g L-天冬酰胺酸（Asparagine）2.0gKH2PO41.0g MgSO4·7H2O 0.5g Fe（NO3)3·9H2O 0.2mg ZnSO4·7H2O 0.2mgMnSO4·4H2O 0.1mg VB1氢氯化物（Thiamin hydrochloride）100g维生素H（biotin） 5g 蒸馏水补足1000mlWA培养基水-琼脂培养基（Water-agar medium） 琼脂 20g蒸馏水补足1000ml将所有培养

42、基进行高压蒸汽灭菌，然后在超净工作台上将15ml倒入皮氏皿中或5ml加入试管中。二、操作步骤“地衣碎片的培养”同“地衣碎片的重分化或组织培养”有着相类似的操作。但这两种方法所用的培养基和光照条件不同。前者所用培养基为LB培养基或MY培养基，培养条件为无光，而后者培养基多为乏营养或无营养培养基，在光照或光暗交替的条件下培养。第一个方法会形成不分化的细胞团，第二个会产生小的地衣体。1地衣体碎片培养（地衣组织培养法）（1）用剪子或解剖刀从地衣体上切取一部分（枝状地衣长为1cm，叶状或壳状地衣为1cm2），然后在自来水中冲洗30分钟至1个小时。（2）在超净工作台上将所取部分放在研钵中，加入3ml无菌水

43、（要用无菌的移液管加入）研磨。（3）将匀浆通过一个网孔为500um的尼龙筛过滤。去除残渣。然后再将所得的滤液通过一个网孔为150um的尼龙筛过滤。这样通过双重过滤就可以除去损坏细胞残渣和较大的地衣碎片。所得到的地衣碎片大小为150500um。（4）在实体显微镜下用无菌竹棍从尼龙筛上挑取地衣碎片。接种到装有5ml斜面MY琼脂培养基的试管中培养。所用试管长为10.5cm，需要装2550个试管。然后盖上灭过菌的铝盖。（5）将试管放在温度为15的培养箱中，无光培养。一周或两周内一些试管内污染的真菌或酵母菌就会快速生长，并覆盖地衣碎片，应该在它们的孢子传播之前就将污染试管去除。（6）接种两周之后，地衣共

44、生菌的菌丝体或藻就会长出地衣碎片。（7）六个月以后，将含有共生菌藻的细胞团移到新的MY琼脂培养基上。培养基应装在直径为6090mm的皮氏皿中。（8）每3到6个月将细胞团转移到新的培养基上，并在15无光的条件下培养。2通过地衣碎片重分化出微小地衣体14步同上 ，然后：（5）将试管在温度为15的培养箱中培养。培养条件为光照下（2.6W/m2）或在光暗交替下。一周内，污染的真菌或酵母菌会在一些试管内快速生长。扔掉所有污染试管。（6）六个月以后，将由共生菌藻形成的未分化的细胞团而长出来的地衣微体转移到新的MY或WA培养基上。培养基应装在直径为6090mm的皮氏皿中。3共生菌的分离在1操作中第七步之后形

45、成包含共生菌藻的细胞团可以用来共生菌的分离。之后进行共生菌的无菌培养，如果有必要可以进行重建实验。（1）将小的细胞团转移到研钵中，加入13ml无菌水进行研磨。（2）用无菌水将1ml匀浆溶液稀释10倍。（3）取1ml稀释液转移到装有MY琼脂块的皮氏培养皿中（直径为90mm）并在1520下进行培养。（4）约36个月后，培养基表面上就会出现克隆体群体。分别挑取绿色的共生藻同丝状的共生菌，并转移到斜面培养基上。在一到三个月后，扔掉污染有其他共生体的试管。如果所有试管均污染了，就要从第一步重新开始。（5）将未污染试管作为纯的共生体群体保存。三、实验结果：1地衣碎片的培养（1） 污染：表一显示了16种地衣

46、在进行地衣碎片培养时污染的程度。表面光滑的地衣或含有抗生素的地衣如Cetraria islandica、Evernia prunastri、Usnea diffracta和U.longissima污染率很低。然而，具有粉芽和裂芽的地衣，以及生长在土壤中的地衣如Cladonia coccifera、C.pleurota、Ramalina yasudae和Usnea rubeescens污染率很高。这说明外来微生物的污染发生在这些地衣体本身。地衣共生菌形成紧凑的克隆体，或产生较短且较厚的菌丝体，也有可能产生短棒状的天线菌丝体。然而，仅接种一个月后，很难区分地衣共生菌与污染真菌。（表1 P41）（2

47、）季节变化：表2显示了采集的季节并不影响Usnea bimolliuscula和U.rubescens 的生长与污染。（3）采集地点的变化 表三表明了在日本不同地点采集的地衣仅轻微影响地衣碎片的污染与培养。我们在对其他属的地衣的培养如Cladonia sp.、Cetraria sp.和Umbilicaria sp.也得到了类似的结果。（4）培养条件：关于温度与光照，Yamamoto et al.（1987）报道了光照与温度对未分化细胞团生长的影响。光对其最初生长的影响主要依据于培养的种类。阿尔匹斯地衣Alectoria ochrolecuca未分化细胞团的生长仅在15度下受到诱导。然而，亚热带

48、雨林的地衣如 Ramalina boninensis 和R.pacifical的未分化细胞团的生长可以同时在15，25下被诱导。（5）培养条件：培养基，自从Ahmadjian最初使用MY培养基培养Cladonia的共生菌以来，我们经常用该培养基。然而，MY培养基并不适合一些属的地衣共生菌和地衣碎片的培养，这些包括Anzia、Gymnoderma和蓝细菌类地衣（Lobararia、Nephroma、Peltigera、Soleria和Stictaetc等）。我们还注意到琼脂培养基还可以抑制Letharia属地衣孢子的萌发（yamamoto et al. 1998）。（6）培养条件：一些激素如生长

49、素、细胞分裂素、赤霉素可以调控植物细胞的生长与分化。然而，在地衣碎片的培养基中加入激素维生素和其他有机化合物并不能明显的促进其生长（Yamamotoet al.1998, Yamamoto et al.未公开资料）。（7）采集后地衣的存储时间：了解地衣在采集后可以在实验室条件下存储多长时间仍能保持活性是十分有意义的。表4显示了生长在冰箱或培养箱中的地衣在各种温度下存储时间。当地衣存放在温度为25的培养箱中，一个月内Usnea属的会死亡，而其他属如Rimelia和Parmotrema却仍能活着。当保存在25的冰箱中时，许多地衣仍能存活13年，在-80的条件下则可以存活5年。2通过地衣碎片或细胞团

50、的重分化获得地衣微体（1）培养基的影响：Yoshimura et al.（1990）报道了培养基营养对Usnea rubescens和Peltigera praetextata地衣碎片重分化的影响。U.rubescens在含有更少的葡萄糖和天冬酰胺酸的改进培养基上比标准的LB培养基上生长的更好。而P.pratextata则在WA培养基上比在MDM和MY培养基上长势更好。Kon et al.（1997）研究了MY培养基中的琼脂密度对U.confusa ssp.kitamiensis地衣碎片培养的影响。低水分琼脂（即 高琼脂密度）可以很明显的影响地衣微体的重分化。（2）温度的影响：地衣在自然界的最

51、适生长温度为1520度。表5显示了培养温度对U.confusa ssp.kitamiensis 地衣碎片分化的影响。表明了该属分化的最适温度为18。四、一些问题解答1微生物污染地衣体的污染取决于它的基物。生长在土壤中的地衣难以培养。因为当在培养一个月后，仅有少数的试管未被污染，这样就很难获得培养的成功。如果碎片污染率较高，用较小的筛孔的筛子过滤也许会有用。也可以改变所用培养基、温度或光暗周期，或干脆用另一个标本或种类培养。2昆虫的破坏通常地衣共生菌和真菌一样容易招小虫子而引起培养群体的污染。将琼脂块上长有虫子的皮氏培养皿放在25下过夜，就会很容易的杀死小虫，而不影响共生体生长。3地衣碎片不能生

52、长如果用LB和MY培养基不能使地衣微体或蓝细菌地衣生长，就应寻找适合这些地衣的培养基（可见第3章）五、评述：生长因素：在实验室中进行地衣群体或地衣碎片的培养十分慢，他们的生长速率不能够满足工业的大量需求，因此我们鼓励其他学者对调控地衣生长的机理进行研究。绿藻对地衣形态发育的影响：Kinoshita et al研究了Usnea hirta共生菌形成一个地衣的能力。首先共生菌在MY琼脂培养基上形成小的分支，像线状的地衣微体。然而在此后的7个月中地衣微体不再变大。这说明，共生藻对地衣的分化有重要的作用，另一个研究藻类对地衣形态发育影响的方法是地衣重建试验，我们可将原来的共生藻换用另一种不同的藻来研究

53、。光合共生体的研究：通过分离的地衣共生菌藻进行地衣的人工重建，可以对光合共生体进行研究，如：Yoshimuia et al报道的含有绿藻的蓝细菌地衣Peltigeia aphthosa的重分化实验。详细细节可见第三章。应用次生代谢物的生产：培养的地衣碎片和共生菌菌落并不一定产生与原有完整地衣体一样的次生代谢物，Yoshimuia et al对100份培养的地衣碎片和共生菌进行了调查研究，只有20份产生了同自然地衣体一样的次生代谢物，60份产生了不同于田野采集地衣的不明次生代谢物，而20份则没产生地衣代谢物。很明显，培养条件可以影响群体次生代谢物的产生。我们已经知道，一些次生代谢物的成份取决于高

54、等植物群体组织分化的程度。Kinoshita et al称由培养的Usnea hirta地衣碎片产生的usnic acid的成分同其的形态发育的复杂性成正比例增加。尽管还需要进一步的研究，这种方法也许会迈出地衣经济利用的第一步。第三章 光合共生体的重建简介有时，有些叶状地衣是由一种共生菌同蓝细菌或绿藻形成的共生体。甚至，同一种共生菌可以形成两种不同的形态，这主要出现在生长在绿色叶状地衣体上的蓝细菌壳状地衣。这种情况尤其发生在Peltigera,Lobaria,Nephroma,Sticata and Pseudocyphellaria属的地衣。这种“一真菌-两形态”假说说明了地衣共生菌可以同原

55、核蓝细菌和/或真核绿藻产生共生关系。我们经常所用的“光合共生体”来源于早期的“藻共生体“，包括了二形态地衣以及由不同绿藻或蓝细菌形成的地衣和衣瘿地衣。由于，光合共生体在自然生态系统中或有或无，因此，他们的起源难于理解。也许，共生子囊真菌进化出高度可塑性的表型有助于他们适应自然界中经常变化的生长条件。对野外Sticta filix的研究表明光照的强度决定了共生藻是蓝细菌还是绿藻，介于蓝细菌和绿藻还存在着中间类型。三共生体系中的共生菌具有高度地对蓝细菌有专化性，这种专化性可以认为是共生菌对蓝细菌所提供营养的专化性。许多这种地衣一般具有较大的地衣体，并且生长在营养贫乏的基物上。他们依靠于发生在蓝细菌

56、循环中的高效的固氮合成体系，该体系已由Feige,Rai et al和Rai在衣瘿和各种蓝细菌地衣中进行的研究。蓝细菌专化地衣共生菌的分离具有很大的挑战性，因为他们需要同蓝细菌结合才能生长。一个方法是将他们同分离的蓝细菌克隆体一同培养。另外，也可以在培养基上加一些富氮的化合物来弥补蓝细菌的缺失，在过去的20年里，许多科学家已经对很多新的光合共生体进行了描述和研究，如James 1975;James and Henssen1976;Brodo and Richardson1978;Tnsberg and Holtan-Hartwig1983,Ott1988;Armaleo and Clerc1991。最近，对地衣的研究进入了一个新的时期。现代实验操作，使在人工创造的可控制的实验环境下进行地衣的分离和重建成为现实。此方面的研究对于共生体的专性和人工重建地衣次生代谢物的产生以及共生体进化的理解有着重要的意义。不久的将来，生物分子技术也许会用来产生具有新的特点的共生体。但是，这需要对影响人工重建共生体和自然共生体生长因素的进行进一步的研究。早期的共生实验主要针