美国进境大豆北方茎溃疡病菌的分离与鉴定_图文

1、 收稿日期 : 2006-09-17美 国 进 境 大 豆 北 方 茎 溃 疡 病 菌 的 分 离 与 鉴 定张建成 , 顾建锋 , 徐 瑛 , 陈先锋(浙江宁波出入境检验检疫局 315012摘要 在对美国进境大豆检疫过程中 , 对大豆籽粒和夹带茎秆进行病原真菌的分离培养 , 使用形态学和分子生物学 相结合的方法对可疑菌株进行鉴定 , 确定该菌为 Diaporthe p haseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow&Caldwell 。 该病原菌是进境植物检疫潜在危险性病原真菌 , 在国内属首次截获 。关键词 大豆北方茎溃疡病菌 ; 鉴定

2、; 分子生物学 中图分类号 S 41-33Isolation and identif ication of soybean Gu Xu Y ing , Chen Xianfeng(it ry I ns and Quarantine B ureau , Zhej iang 315012, China Abstract isolated f rom soybean seeds and stems imported f rom USA was identified. Both morpho 2logical and molecular characteristics showed it was Di

3、aporthe phaseolorum (Cke. &Ell. Sacc. var. caulivora Athow &Caldwell. This is the first report on this f ungus in China and it is a potential dangerous f ungus of soybean. K ey w ords Diaporthe phaseolorum var. caulivora; identification ; molecular biology 大豆北方茎溃疡病菌 (Di a port he p haseolorumvar. ca

4、uli vora , DPC 是我国进境植物检疫潜在危 险性真菌 1, 且被列入新修订的进境植物检疫性病 虫杂草 A1类检疫名录 (未公布 。最先于 20世纪 40年代后期在美国 Iowa 州发现 , 当时病原菌被命名为 D. p haseolorum var. bat at atis 。随后 ,At how 和 Caldwell 将 它 改 名 为 D.p haseolorum var.cauli vora 。 20世纪 50年代 , 北方茎溃疡病在美国中北部地区流行 , 引起产量损失高达 50%。目前分 布于美国北部地区 、 加拿大 、 意大利 、 巴西 、 阿根廷 、 前南斯拉夫 。 并

5、且疫区还在不断扩大 , 是国外大豆 生产上的重要病害 , 经济影响很大 2-3。该病菌可通过种子和病残体远距离传播 , 并且 抗逆性很强 , 病残体在 -18 -15 下可存活 14个月 。 目前 , 我国尚没有 DPC 发生危害的报道 ,但是中国大豆生产从北到南在不同气候带都有分 布 , 其中有很多和疫区相似的气候区 , 一旦该病害传 入我国 , 在适宜的条件下定殖 , 将对我国的大豆生产 产生严重影响 。2004年以来 , 宁波口岸加大了对进境大豆下脚料的检疫力度 , 有针对性地对间座壳属 (Di a port he , 无性态为拟茎点霉属 Pomosis 病原菌进行检测 。 2005年

6、6月 , 在美国进境的大豆下脚料中截获一病菌 , 通过形态学和分子生物学相结合的方法对其进 行了鉴定 , 确定其为 DPC , 初步建立了一套 DPC 的 鉴定方法 , 这是国内首次截获并报道该病菌 , 并于 2006年初用此方法再次检出该病菌 。1 材料与方法1. 1 材料美国进境大豆中夹带的豆秆及干瘪的大豆籽粒。 1. 2 分离培养 挑取有病斑或褐变等可疑症状的豆秆 , 使用 1%次氯酸钠 (NaOCl 对其进行表面消毒 30s , 灭菌 水漂洗 3次 , 置于铺好 3层湿润吸水纸的培养皿中 , 12h 光照 ,12h 黑暗交替 ,25 恒温保湿培养 ,5d后每天观察 。 将选取的干瘪的大

7、豆籽粒使用同茎秆 相同的表面消毒方法 , 在 PDA 培养基上 25 恒温 培养 ,5d 后每天观察 。 将上述方法培养出的真菌菌 丝或子实体在 PDA 平板上分离纯化 。401 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007调 查 研 究1. 3 形态鉴定在 L EICA S8APO 解剖镜和 ZEISS Axioskop 40显微镜下观察病原菌在豆秆上形成的子囊壳、 子囊和 子囊孢子 , 使用 L EICA DFC320数码摄像头配合 L EI 2 CA Qwin V3软件记录其形态并测量大小。并对 PDA 平板上的菌落形态 , 产

8、孢情况进行详细记录。 1. 4 致病性测定使用牙签法 4, 在苗龄 14d 的大豆幼苗下胚轴 用牙签划一伤口 , 取菌龄 7d 的菌落边缘菌块 (直径 约 4mm 覆盖于伤口 , 用无菌凡士林封闭伤口 , 接种 4株 , 并用 PDA 培养基小块作对照 。接种后的前 72h , 在气候箱内保持相对湿度 90%以上 。1. 5 分子生物学鉴定1. 5. 1 总 DNA 提取采用易润华等的方法 5。 1. 5. 2 Pomo sis/Diaport he 属特异 PCR参照 A W ZHAN G 等方法 6, 对sis/Diaporthe I I I分 离 物 总 PhomI:5 -GA GCTC

9、GCCACT A GGG -3 , PhomII: 5 -GGCGGCCAACCAAACTCTTGT -3 。 引物由 上海博亚生物技术有限公司提供合成 。以本实验室 分离保存的 Phomopsis lon gicoll a 做阳性对照 , 以 重蒸水做阴性对照 。 PCR 反应总体积 50L , 反应 体系中各试剂的终浓度为 :1buffer 、 2. 5mmol/L MgCl 2、 0. 2mmol/L dN TP 、 引物各 50p mol ,2. 5U Taq 聚合酶 (Takara , 大连 、 模板 DNA 25ng 、 用 dd H 2O 使终体积达到 50L 。使用 GeneA

10、mp PCR System 9700PCR 仪 (AB I 公司 进行 PCR 反应 , 反 应过程为 96 热变性 3min ; 然后进行 40个循环 , 每个循环 95 变性 0. 5min 、 60 退火 0. 5min 、 72 延伸 1min ; 最后 72 延伸 7min 。1. 5. 3 ITS 区 PCR用真菌通用引物 ITS4和 ITS5扩增总 DNA , 由 上海博亚生物技术有限公司合成 (ITS4:5 -TC 2 CTCC GC T TA T T GA TA T GC -3 , ITS5:5 -GGAA GTAAAA GTC GTAACAA GG -3 。反应 体系同 P

11、homopsis 属特异 PCR 体系 。使用 Gene 2 Amp PCR System 9700PCR 仪 (AB I 公 司 进 行 PCR 反应 , 反应过程为 96 热变性 3min ; 然后进 行 35个循环 , 每个循环 94 变性 1min 、 55 退火 1min 、 72 延伸 2min ; 最后 72 延伸 7min 。 1. 5. 4 DNA 测序ITS 区 PCR 产物经纯化后直接用于测序 ,DNA 测 序由上海生工生物工程科技有限公司完成 , 使用 ABI 3700测序仪 , 采用双脱氧测序法 , 测序引物为 ITS4和 ITS5, 进行双向测序。 校对测序结果并拼

12、接序列。 1. 5. 5 RFL P 分析ITS 区 PCR 产 物 使 用 限 制 性 内 切 酶 A l u I , Rsa I , H ha I , Mse I 和 S cr FI (Takara , 大连 进行酶 切 , 按照每种酶的说明书 , 将 1. 0L 限制性内切酶 , 1. 5L 10buffer ,6L PCR 产物 ,6. 5L dd H 2O 混合 , 在每种酶的适宜酶切温度下孵育 3h 。 PCR 酶切产物在 2%的琼脂糖凝胶上电泳 , 根据 Marker 判断 DNA 片段大小 。1. 5. 6 数据分析(BL AST 搜索 , 比 。 GenBank 上选取同属的

13、代表性菌株 , 并以 Gaeu 2 m annom yces g rami nis 做为序列分析的外群 7。利 用 ClustalX 1. 8. 1进行序列比对 , 通过 M EGA 3. 1软件选用 K imura 22parameter 距离模型进行 U P G 2 MA 分析生成系统发 育树 , 发育 树用 自展 (Boot 2 st rap 分析法进行检验 , 循环 1000次 。2 结果与分析2. 1 形态描述保湿培养 14d 后 , 肉眼可见灰褐色豆秆上生出 大量黑色的突起 (图 1a , 为病菌的子囊壳喙 。子囊 壳后期溢出一条条白色须状的孢子角 。子囊壳黑 色 、 球形 , 单

14、生或 212个丛生 , 直径 (165340 m (282412 m , 埋生于豆秆表皮中 。喙表面光 滑 , 喙长 180336m , 宽 75110m , 喙宽度均 匀 , 顶 部 钝 圆 。子 囊 (5. 65. 8 m (25. 7 27. 8 m , 长棍棒状 , 壁薄 , 易消解 , 顶部有清晰的折 光环 。 子囊孢子 (2. 32. 5 m (8. 18. 4 m , 透明 , 纺锤形 , 双细胞 , 分隔处略缢缩 , 常含油球 。 同时 PDA 平板上培养的带病种子生白色絮状 霉层 , 挑取纯培养 。两种方法得到的纯培养菌株都 性状相似 , 在 PDA 培养基上 2025 下生

15、长良好 , 7d 后长满培养皿 , 菌落白色 , 丛生絮状长毛 , 后期菌 落颜色 无变 化 , 只 在 培 养 基 背 面 有 黄 色 素 产 生 。 28d 后 , 子囊壳在不发达的小子座上形成 。子囊形 状大小与大豆茎秆 、 种子分离物相似 。未见分生孢 子器及分生孢子 。 5 01调 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007 PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 图 1 大豆北方茎溃疡病菌培养物形态2. 2 致病性测定两种分离物分别接种大豆幼苗 。伤口接种 7d后可见创口边缘呈褐色 , 且延伸状扩展 , 整株枯萎 ,4株大豆幼苗都发病死亡 , 对照

16、仅在伤口处有破损 。剪取接种点上下部茎秆 , 经表面消毒后用 PDA 培养基分离 , 获得纯培养 , 其菌落特征 、 子囊孢子形态大小与豆秆及带病种子原始分离物纯培养一致 。2. 3 分子生物学鉴定使用 Phomopsis 属 特 异 性 引 物 Phom 和Phom 扩增阳性对照 P. lon gicoll a 和待测菌株 ,得到 1条 300bp 左右的特异性条带 , 如图 2, 和报道的 337bp 条带大小基本吻合 6。使用 5种限制性内切酶对 ITS 区扩增产物进行酶切 , 得到酶切图谱如图 3。 5种限制性内切酶有不同的酶切位点 , 根据 Marker 可以判断出酶切片段的大小范围

17、 。 文献报道 ,DPC 的 PCR 产物长度 600bp左右 , 酶 RsaI 没有酶切位点 , 其他 4种酶切产物的特征片段长度分别是 :A l u I ,281bp 、 176bp ; 第 3条为 145bp 或 146bp ; H ha I ,260bp 和 226bp ; 还有一类菌株是 228bp 和 134bp ; Mse I ,484bp ; S cr FI ,254bp 和 96bp 8。 对比研究菌株的酶切图谱 , 可以初步判定与报道的 DPC 病菌酶切结果相似 。图 2 Phomopsis 属特异性引物扩增结果图 3 大豆北方茎溃疡病菌 PCR 2RF LP 酶切图谱两种

18、来源的分离物的 ITS 区 PCR 扩增产物经 测序比对 , 发现碱基序列完全相同 , 共有 601bp 。 序 列在 GenBank 上进行 BL AST 搜索 , 经比对分析 , 所 检测的样品的序列同 Zhang 等人报道的 D. p hase 2 olorum var. cauli vora 菌株 713的序列 (A F000567 完全 相 同 ; 与 其 他 两 种 被 鉴 定 为 DPC 的 序 列 (A F000563,A F000212 都仅有 1个碱基的差异 , 相 似度也达到 99%。聚类树说明测试菌株与其他两 个 DPC 菌株成为一组的支持率相当高 。根据分离菌株的子囊

19、及子囊孢子的形态特征能 够鉴定到 Diaporthe 属 , 同时由该菌株能够使大豆幼 苗致病 , 是大豆上的一种寄生菌 , 结合进境大豆常见 病原真菌的特征 , 可以初步判定该菌株属于 Dia 2 porthe phaseolorum , 根据文献报道 9, 由子囊着生特 征、 子囊孢子大小可以判断接近于 DPC 。 分子生物学 方法 结 果 表 明 该 菌 株 属 于 Pomosis/Diaporthe 属。 PCR 2RFLP 分析表明与 DPC 酶切图谱非常相似。 ITS 保守区的基因分析表明此种真菌在序列上与 DPC 的 一个菌株完全相同 , 与 Pomosis 属其他种的遗传距离

20、较远 , 所以可以判定此种真菌是 DPC 的一个菌株。 6 1 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007调 查 研 究 Template. 本次研究的菌株 ; 其余序列左边是 GenBank 中的登记号 , 右面对应其种类图 4 基于 ITS rDNA 序列经 UPG MA 检测的系统发育树 (分支上的数字代表 1000次自举检测支持率 3 讨论大豆北方茎溃疡病病原菌属于子囊菌门、 球壳目、间座壳科、 间座壳属 , 无性阶段为拟茎点霉属。 在美国、阿根廷等国大豆生产上 , 能与大豆茎荚枯腐病菌 (黑点病菌 (D. phaseolor

21、um var. soj茎点种腐病菌 (病菌 (D. (DPM 共同引起间座壳 -Diaporthe 2Phomopsis com 2plex , 危害超过其中任何单一真菌病害 9。 除 DPS 外的其余 3种病菌在我国未见报道。近年来 , 从美国 、 巴西 、 阿根廷等国进境的大豆逐年增加 ,2005年海关统计数据达到 2659万 t 。 本试验证明不但大豆籽粒能够携带病菌 , 大豆茎秆等大豆下脚料也可以成为带菌载体 。而所有进境大豆中都携带着大量豆秆 、 豆荚 、 土块 、 各类杂草籽等杂质 。 如果对进境大豆的检测能力不足 , 对大豆加工厂的监管不严 , 很可能造成各类危险性有害生物的扩散

22、和危害 。 因此 , 必须加强对大豆危险性有害生物检测和鉴定方法的研究 , 尽快在各口岸推广 。另外还要进一步加强对各大豆加工厂的检疫监管 , 对下脚料进行无害化处理 , 严防有害病菌入侵 。笔者曾于 2004年 3月从美国大豆秆中检出 P.longicolla, 由于该病菌未发现有性阶段 , 分生孢子器表面较粗糙 , 茎秆保湿培养分生孢子产生时期较早 ,较容易与其他 3种病菌区分。 DPS 的子囊和子囊孢子明显较大 , 也较容易区分。 DPC 与 DPM 很接近 , 子囊和子囊孢子差异不大。 有报道称 DPM 子囊壳散生 , 喙宽 100m 左右 , 菌落老熟后呈褐色 ; 而 DPC 子囊壳

23、丛生 , 喙宽 60m 左右 , 菌落老熟后仍呈白色 9。但在实际鉴定过程中 , 大豆茎秆上的 DPC 也有密集和散生的情况 , 喙的长宽也因不同菌株而有差异 , 子囊、 子囊孢子的大小也有不同。 近年来 , 利用病原菌核糖体 ITS (internal transcribed 区域进行病害诊断 区具有相对保守 性 , , 可以通过 PCR, 随着 DNA 测序技术的不断成熟 , , 而时间在不断缩短。 病 原真菌通过在 G enbank 比对基因保守区测序结果 , 结 合形态学检测结果和致病性鉴定结果 , 鉴定到菌株所 属种的方法已经趋向成熟。通过大豆病原真菌的更多检出与标准菌株的积 累 ,

24、 可以在 ITS 区序列基础上设计特异性引物 , 直接 从大豆种子和豆秆上检测区分大豆上的各种检疫性 病原物 , 以满足口岸检测准确 、 快速的要求 。参考文献1 吴品姗 , 严 进 . 值得关注的大豆新病害 J.植物检疫 ,2003, 17(4 :226-228.2 BACKMAN P A , WEAV ER D B , MOR GAN 2J ON ES G. Soy 2 bean stem canker :anemerging disease problemJ.Plant Dis 2 ease ,1985,69(8 :641-647.3 PIOL I R N , MORANDI E N ,

25、 MAR TIN EZ M C ,et al. Mor 2 phologic , molecular and pat hogenic characterization of Dia 2 port he p haseolorum variability in t he core soybean producing area of ArgentinaJ.Phytopat hology ,2003,93:136-140. 4 KEEL IN G B L. A seeding test for resistance to soybean stem canker caused by Diaport he

26、 p haseolorum var. caulivora J. Phytopat hology , 1982,72:807-809.5 易润华 , 朱西儒 , 周而勋 . 简化 CTAB 法快速微量提取丝状真菌 DNAJ.湛江海洋大学学报 ,2003,23(6 :72-73.6 ZHAN G A W , HAR TMAN G L , RICCIONI L ,et al. Using PCR to distinguish Di aport he p haseolorum and Phomopsis longicolla from other soybean fungal pathogens an

27、d to detect them in soybean tissuesJ.Plant Disease ,1997,81:1143-1149. 7 FARR D F ,CASTL EBU R Y L A , ROSSMAN A Y. Morpho 2 logical and molecular characterization of Phomopsis vacci nii and additional isolates of Phomopsis from blueberry and cranberry in the eastern United StatesJ.Mycologia ,2002,9

28、4:494-504. 7 0 1调 查 研 究 第 33卷第 2期 (2007PLAN T PRO TECTION Vol. 33No. 2(2007 8 ZHAN G A W ,RICCIONI L ,PEDERSEN W L ,et al. Molecu 2lar identification and phylogenetic grouping ofDiaport hephaseolorum and Phomopsis longicolla isolates from soybeanJ.Phytopat hology ,1998,88:1306-1314.9 HARTMAN G L , S

29、INCLAIR J B , RUPE J C. Compendium ofS oybean Disease (4th Edition M.Minnesota :APSPress ,1999.收稿日期 : 2006-08-083致 谢 : 本文昆虫学名由浙江大学徐志宏教授鉴定 。双 斑 锦 天 牛 的 生 物 学 特 性 及 防 治3余黎红 , 陈国利 , 刘国军(浙江省常山县林业局 324200摘要 双斑锦天牛 A calole pta subl usca (Thomson 在常山县危害大叶黄杨 ,1年发生 1代 , 以老熟幼虫在受害植株 蛀道中越冬 ,4月上旬至 6月中旬化蛹 ,5月上旬至

30、7月上旬成虫羽化 ,5,5月中旬幼虫孵 化 ,11月幼虫停止取食进入越冬 。 根据其生活习性提出了综合防治措施 , 关键词 双斑锦天牛 ; 生物学特性 ; 防治措施 中图分类号 S 433. 5pt a subl uscaYu , Chen Guoli , Liu Guojun(Forest ry B ureau of Zhej iang Province , 324200, China Abstract Only one generation of Acalolepta sublusca (Thomson occurred in a year in Changshan , Zhejiang

31、Province , and it overwintered as old larvae in the tunnels of the trunks. The overwintering larvae pupated from early April to mid 2J une. The adults emerged from early May to early J uly. The females began to lay eggs in early May. The larvae appeared in mid 2May. Integrated control measures were taken ag