苦瓜花粉生活活力检测方法的比较研究

1、苦瓜花粉生活力检测方法的比较研究摘 要苦瓜是一种重要的蔬菜作物，研究苦瓜花粉活力的检测方法，可以为苦瓜的杂交育种工作提供前期的参考。离体萌发法是普遍认为检测花粉活力最接近花粉的实际生活力，但该法所耗的时间长，所以本研究通过其他方法与离体萌发法比较，选出适宜苦瓜花粉活力快速检测的方法。本研究用碘碘化钾染色法、TTC染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶法、无机酸法和离体萌发法对苦瓜花粉活力进行研究，得出碘碘化钾染色法、TTC染色法、醋酸洋红染色法、无机酸法测出的花粉活力与离体萌发法有极显著的差异，过氧化物酶染色法与离体萌发法测得结果没有达到显著差异，且这两种方法测得苦瓜花粉活性分别为：过氧化物酶染色

2、法04-1725：62.27%，04-17：70.72%；离体萌发法04-1725：66.99%，04-17：72.48%。通常认为离体萌发法测出的花粉萌发率是做接近自然状态的花粉活力，所以研究得出的结论为过氧化物酶染色法适宜苦瓜花粉生活力的快速检测。蔗糖基本培养基上添加硼酸能够显著促进苦瓜花粉萌发，苦瓜花粉离体萌发的合适培养基配方和浓度有待进一步研究。关键词：苦瓜；花粉活力；测定方法AbstractBitter gourd is an important vegetable crops, pollen viability of the detection method of bitter g

3、ourd, bitter gourd of cross-breeding can provide early information. Germination in vitro testing method is generally considered the actual pollen viability Pollen viability of the closest, but the time consumption of the law long, so this study by other methods compared with the in vitro germination

4、, pollen viability bitter election of suitable methods for rapid detection of . In this study, iodine - potassium iodide staining, TTC staining, aceto carmine staining, peroxidase, inorganic acid and in vitro germination of pollen viability studies bitter, drawn iodine - potassium iodide staining, T

5、TC staining , aceto carmine staining, inorganic acid measured in vitro pollen germination vigor and there were significant differences in peroxidase staining and measured in vitro germination results are not significantly different, and the various ways in these two measurements Pollen viability was

6、 bitter gourd were: peroxidase stain for the 04-17 25:62.27% ,04-17: 70.72%; in vitro germination 04-17 25:66.99% ,04-17: 72.48%. Usually that measured in vitro germination of pollen germination rate is close to natural state do pollen viability, the study concluded that the bitter gourd peroxidase

7、staining method suitable for rapid detection of pollen viability. Basic medium supplemented with sucrose, boric acid can significantly promote pollen germination bitter, bitter melon pollen germination in vitro is concentration of the appropriate culture medium to be studied further. Keywords：Bitter

8、 gourd；Pollen viability；Determination目 录摘 要1Abstract21前言41.1花粉生活力的检测方法41.2花粉活力测定方法的研究进展。41.3目的和意义62材料与方法62.1材料6供试材料采集自园艺园林学院教学基地，上午八点之前采集当天开放的，04-17与04-1725两个品系的花朵，放在有冰块的泡沫箱中拿回实验室立刻做实验。62.2方法6碘碘化钾染色法13,326醋酸洋红法337TTC法3,247过氧化物酶法347离体萌发法7无机酸法1383结果与分析83.1不同方法鉴定花粉生活力8碘碘化钾染色法鉴定花粉活力8醋酸洋红染色法鉴定花粉活力9TTC染色法

9、鉴定花粉活力9过氧化物酶法鉴定花粉活力9离体培养法鉴定花粉活力9无机酸检测花粉的活力103.2品种间测定结果的比较103.3不同方法的比较114结论与讨论114.1结论11致谢13参考文献141 前言1.1 花粉生活力的检测方法目前花粉活力的测定方法有染色法中的碘碘化钾染色法1、醋酸洋红法2,3、TTC染色法4-6、FCR法7、联苯胺染色法（过氧化物酶染色法）8,9、MTT法10-12，萌发法中的离体萌发法和活体萌发法，还有田间授粉法、形态鉴定法、无机酸法13,14。本研究采用碘碘化钾染色法、醋酸洋红法、TTC法、过氧化物酶染色法、离体萌发法、无机酸法。碘碘化钾染色法是根据淀粉遇碘变蓝的特性，

10、根据蓝色的深浅程度来判断花粉粒中淀粉的含量，从而确定花粉粒活性的高低；醋酸洋红法的染色原理是靠花粉中的脱氢辅酶而染色，有活力的花粉被染成红色，部分失去活力的呈现粉红色，而无活力或不育的花粉无色；TTC法基本原理是，当TTC渗入细胞后，遇到活细胞里的脱氢酶接受氢离子，由无色的氧化型变成红色还原型不溶于水的化合物，由此来判断花粉的生活力；FCR法基本原理是荧光染料本身不产生荧光，无极性，并能自由地透过完整的原生质膜。当此种染料进入原生质后，即被醋酶作用形成一种能产生荧光的极性物质荧光素。由于荧光素不能自由地出人原生质膜，而只在细胞内积累，因此可以根据花粉产生荧光的情况来判断花粉的生活；MTT染色法

11、是根据花粉粒中脱氢酶的活性判断花粉生活力，适用试剂是四唑盐类染料，染料的配制方法为:1% 2,5-联苯四唑溴化物(MTT或噻唑兰)溶于5%蔗糖；活体萌发法基本原理是15，具有花粉管的花粉粒能被锚定在柱头上，并且不会被漂洗掉，因此可以通过漂洗柱头和比较漂洗前后柱头上的花粉粒数目来推测其萌发率；田间授粉检测法基本原理11是根据果实和种子的形成情况来判断花粉生活力；无机酸检测法，也称瞬时花粉管法，基本原理是，由于酸对花粉粒质膜的刺激作用，使质膜变得非常脆弱，通透性也增大，以致大量地吸收H+，使内压迅速升高并导致质膜膨胀，最后活性花粉的胞质内含物就会喷射而出，形成“瞬时花粉管”。1.2 花粉活力测定方

12、法的研究进展。不同的植物适应的花粉检测方法不同。在辣椒花粉活力测定最佳方法的筛选试验时张子学16,17等得出的结论是，离体萌发法和TTC法适用于不同贮藏时间的花粉生活力的测定，而碘-碘化钾染色法、醋酸洋红染色法、过氧化物酶沉淀法均不能用于贮藏辣椒花粉生活力的测定，以上各种方法皆适合现菜的辣椒花粉活力的检测。而王少先18、严峥19的研究结果是只有离体萌发法是适宜辣椒花粉活力检测。在芸苔属植物花粉萌发和贮藏过程中的生活力测定方法筛选实验中发现离体萌发法是最可靠的方法20，结果表明最佳培养基成分为0.9M蔗糖 +2.43mM硼酸 +2.12mM硝酸钙，温度应保持在20-40之间21。但在黄瓜花粉生活

13、力最佳测定试验的观察中发现TTC染色法才是测定黄瓜现采花粉生活力的最佳染色方法，I-KI染色法、醋酸洋红染色法不适用于黄瓜花粉生活力的测定22。对羊草的研究也发现TTC法优于I-KI染色法23。另外对矮牵牛花粉染色剂的筛选实验中发现用醋酸洋红染色花粉粒均被染成红色，次甲基兰能将花粉粒全部染为蓝色，但-茶酚、联苯氨和TTC三种染色法均无法使花粉着色，因此它们不能作为测定矮牵牛花粉生活力的染色剂24。在对苎麻花粉活力研究时，I-KI、TTC、醋酸洋红的染色效果不理想，得出的结果与离体萌发法相差较大，因此这三种方法适合苎麻花粉活力的检测25。花粉离体萌发需要一系列合适的外部条件如温度、培养基浓度等，

14、萌发温度一般在25时最好，低于18不萌发，如荔枝26棉花花粉萌发及花粉管生长的最高温度为3227，一般来说植物花粉萌发的温度应控制在15-35。蔗糖浓度对花粉发芽率也有很大的影响，大多数物种的花粉在10%的蔗糖浓度下发芽最好。如梨 28、黄皮29、矮牵牛花24，但有些花粉的萌发需要的最佳蔗糖浓度高于10%，如丁香花粉萌发以15%蔗糖+2%琼脂的培养基效果最好，花粉萌发率最高。培养基中除了蔗糖以外还要有一些微量物质，如硼、钙等，不同花粉萌发需要的钙浓度不同，如梨花粉萌发最佳钙浓度为0.03%28；蓝猪耳花粉萌发的最佳Ca浓度为 2.110-4mol/L，萌发频率达65%30；南瓜花粉萌发培养基中

15、硝酸钙300mg/L较为适宜31。1.3 目的和意义苦瓜又名凉瓜，是葫芦科植物，为一年生攀缘草本。原产亚洲热带地区，目前广泛分布于热带、亚热带和温带地区。苦瓜具有特殊的苦味，但仍然受到大众的喜爱，这不单纯因为它的口味特殊，还因为它具有一般蔬菜无法比拟的神奇作用。苦瓜可以除邪热，可解疲乏，清心聪耳明目，润泽肌肤，强身，使人精力旺盛，抗衰老。所以通过遗传育种增加餐桌上苦瓜的品种有重要意义。遗传育种中，花粉是不可缺少的材料，所以在遗传育种中研究花粉的活力成为关键的一步。在花粉生活力检测的方法中，一般都认为离体萌发法效果最好，结果最接近花粉的自然生活力，但是此方法与其他的染色法、无机酸法比较所需时间较

16、长，对快速检测起到相对的限制作用。所以本研究是为了筛选出适宜苦瓜花粉生活力检测的、快于离体萌发法的检测方法。目前对苦瓜花粉生活力检测方的研究较少，本研究对给出适合苦瓜花粉快速检测的方法、苦瓜花粉生活力的其他研究及育种工作有重要的意义。另外，苦瓜是典型的雌雄异花，在繁殖过程中要借助外力才能完成传粉受精的过程。苦瓜杂交过程中，两性之间的传粉是基础，传粉过程始于花药开裂和成熟花粉的散出，携带着雄配子体或其前体的花粉粒被暴露在干燥条件下，必须在具有活力时到达适宜的接受柱头。因此，选择恰当的花粉活力测定方法对其花粉活力的变化规律进行研究，对提高其繁殖效率具有重要意义。2 材料与方法2.1 材料供试材料采

17、集自园艺园林学院教学基地，上午八点之前采集当天开放的，04-17与04-1725两个品系的花朵，放在有冰块的泡沫箱中拿回实验室立刻做实验。2.2 方法2.2.1 碘碘化钾染色法13,32 将1.3gKI溶解于10mL的蒸馏水中，然后放入0.3gI2，待完全溶解后定容至100mL。在载有花粉的载玻片上加2滴碘-碘化钾溶液，用镊子搅拌均匀，并使花粉散开，盖上盖玻片迅速进行观察。凡被染成蓝色表示有生活力或花粉里含有淀粉，未被染色或程黄褐色为缺失生活力。选取五个视野进行观察，统计有活力花粉的百分率，取平均值。2.2.2 醋酸洋红法33将花粉轻轻涂抹在载玻片上，在载玻片上滴入1-2滴醋酸洋红溶液，用镊子

18、搅拌均匀，盖上盖玻片，片刻后在显微镜下观察，有活力的花粉染成红色。选取五个视野进行观察，统计有活力花粉的百分率，取平均值。2.2.3 TTC法3,24取少量花粉直接放人载玻片上，加l滴1TIC溶液，用镊子搅拌均匀，盖上盖玻片，然后放置于30的恒温箱内15min。在光学显微镜下观察，凡被染为红色的生活力强，淡红色次之，无色者为没有生活力的花粉或不育花粉。选取五个视野进行观察，统计有活力花粉的百分率，取平均值。2.2.4 过氧化物酶法34过氧化物酶染色法又称联苯胺染色法，是根据花粉中过氧化物酶的活性来判断花粉的活力。配试剂：0.5%的联苯胺：将0.5 g联苯胺溶于100 mL乙醇中；0.5%-萘酚

19、：将0.5 g-萘酚溶于100 mL 50%乙醇中；0.25%的碳酸钠：将0.25 g碳酸钠溶于100 mL蒸馏水中；0.3%过氧化氢。试验前将溶液各10 mL混合均匀成试剂；溶液为试剂。在干净载玻片上加试剂和各1小滴，放少量花粉,搅匀后盖上盖玻片，30环境条件下，放置30 min，在显微镜下观察。由于有活力的花粉有活跃的过氧化物酶，所用试剂与过氧化物酶发生氧化反应而染色，有活力的花粉被染成红色，无活力的花粉则呈现黄色或无色透明。选取五个视野进行观察，统计有活力花粉的百分率，取平均值。2.2.5 离体萌发法 花粉离体萌发法是另外一种测定花粉生活力的方法，用以弥补花粉不萌发法的不足。取一培养皿，

20、底盖内放1张滤纸，将滴有培养基（10%蔗糖与1%硼酸、10%蔗糖）的双凹载玻片放入其中，新鲜花粉放置于培养基上，于30的恒温箱内培养1 h，用1010倍显微镜随机选取5个视野进行观察，观察花粉萌发情况，以花粉管长度大于或等于花粉直径为标准。计算花粉萌发率。2.2.6 无机酸法13取少量花粉置于双凹玻片内，滴上1滴08 mol/L的硝酸，在510 min内在1010倍显微镜下，随机观察5个视野，重复3次。有生活力花粉的胞质内含物喷射而出形成瞬时花粉管。观察5个视野中形成瞬时花粉管的花粉所占的比例，计算花粉活力百分率。3 结果与分析3.1 不同方法鉴定花粉生活力3.1.1 碘碘化钾染色法鉴定花粉活

21、力从表1可知，碘碘化钾染色法测得的结果有明显的差异，而且花粉活性都在85%以上，04-17超过了95%。碘碘化钾染色法实质是利用花粉内的淀粉遇碘变色去判断花粉有无生活力。利用碘碘化钾染色法测定芒的花粉活性时，碘碘化钾将有活力的花粉染成蓝黑色，说明芒花粉细胞中的淀粉含量较高，但在苦瓜花粉染色时蓝色和褐色之间呈现过度颜色，这个过渡色难以辨认为蓝色或是褐色。所以该法不适合苦瓜花粉活力的快速检测。当花粉保存一段时间后失去活性，但由于细胞中的淀粉依然存在，花粉仍然能被碘碘化钾染成蓝色，若有此方法作为花粉生活力的跟踪，就会被认为花粉的生活力不变，所以此法也只能作为花粉初始活力的检测。表1 不同检测方法的花

22、粉活力品种过氧化物酶染色法TTC染色法无机酸法I2-KI法染色法醋酸洋红染色法离体萌发法+0.01硼酸离体萌发法04-17250-1762.27%70.72%82.55%84.87%81.42%83.08%89.26%95.26%99.1199.8466.99%72.48%0.62%1.33%3.1.2 醋酸洋红染色法鉴定花粉活力从表1看出，醋酸洋红染色法侧的两品种的花粉活力都接近100%，在观测时可见花粉染色明显，易于区分，由于观察到的几乎是被染色的花粉，偶尔会看到一两个不染色的花粉，可以忽略，认为花粉全部被染色，由此可得出此法不适合苦瓜花粉活力的测定。3.1.3 TTC染色法鉴定花粉活力从

23、表1可知，TTC法测得04-1725和04-17的花粉活力基本一致，观察时花粉颜色差别小，有活力的花粉边缘被染成红色，中间呈现黄褐色，而无活力的花粉整个呈现黄褐色，在显微镜下不易分辨。所以认为该法不适宜苦瓜花粉生活力的检测。3.1.4 过氧化物酶法鉴定花粉活力从表1 不难看出过氧化物酶法测得两品种的花粉活力差别较大，其中04-1725为62.27%，04-17为70.72%。此法染色明显，颜色分界线明确，且被染色的花粉边缘附着有气泡，易于区分。染色结果染色率与培养液法测得结果基本一致，但低于离体培养法测得的花粉生活力，可以作为快速测定苦瓜花粉生活力的适宜方法。3.1.5 离体培养法鉴定花粉活力

24、在用离体培养检测花粉活力时采用两种不同溶液，一是纯的蔗糖溶液，另一是向蔗糖溶液中加入0.01%的硼酸。从表1中不难看出，加硼酸的蔗糖培养液花粉萌发率显著高于纯蔗糖培养液，无硼酸的培养液中只有个别花粉萌发，甚至观测不到萌发的花粉，所以得出加入硼酸更适宜苦瓜花粉和活力的检测。3.1.6 无机酸检测花粉的活力由表1看出，用无机酸测定苦瓜花粉活力，得到两个品种的花粉活性基本接近，用此法得到的结果与TTC法无太大区别。苦瓜花粉滴上硝酸几分钟后，可以看见花粉萌发孔有膨胀向外突出的现象（但都小于1倍花粉直径）；但在花粉吸水后也可以观察到萌发孔膨胀外突的现象，所以采用无机酸法不易判断花粉是否真正有生活力。因此

25、，无机酸法也不适于苦瓜花粉生活力的检测。表2 检测方法的平均数比较处理方法 花粉活力平均数差异显著性0.050.01醋酸洋红染色法离体萌发法+0.01%硼酸过氧化物酶染色法I2-KI法染色法无机酸法TTC染色法83.443.6340.335.9725.624.07abbcddABBCCDD3.2 品种间测定结果的比较在所用到的方法中，测得的结果变化趋势一致，都是04-17的活力大于04-1725的活力。过氧化物酶法和离体培养法测得两品种花粉的活力相差较大，且只有过氧化物酶染色法得到花粉活力与离体培养法相近。综合几种方法的检测结果可以初步认为04-17的花粉活力大于04-1725的花粉活力，并且

26、过氧化物酶染色法可以作为这两种苦瓜花粉活力的检测。3.3 不同方法的比较对花粉活力进行发差分析得出，碘-碘化钾染色法、无机酸法、TTC染色法与离体萌发法差异达到了极显著水平，只有过氧化物酶法与离体萌发法的花粉活力差异不显著，比较接近。醋酸洋红几乎将所有的花粉都染成红色，所以得出的花粉活力最大，都在99%以上，TTC法和无机酸法得到花粉活性基本相近，但又与离体萌发法差异较大。综合所得的花粉活力百分率及方差分析可以得出过氧化物酶染色法是最适宜苦瓜花粉活力快速检测的方法。4 结论与讨论4.1 结论1 对苦瓜进行花粉活力测定的六种方法中，以离体萌发法最为准确、简便、稳定地测定苦瓜的花粉活力，测得04-

27、1725的活力为66.99%，04-17为72.48%，但该法所用时间长，要达到最佳的效果一般都要培养1小时以上，对作为快速检测苦瓜花粉活力是存在着时间上的缺陷。2 其他方法与离体萌发法比较，过氧化物酶法染色最佳、效果最好、最易辨认花粉活力的方法，而且得出的结果基本与离体萌发法一致，这两种方法测得04-1725和04-17两个品种花粉的活性分别为：过氧化物酶法62.28%、70.72%，离体萌发法(加0.01%的硼酸)66.97%、72.70%。方差分析得出的结果也是这两者间无显著差异，所以本研究初步认为过氧化物染色法是最适宜快速检测苦瓜花粉活力的方法。4.2 讨论4.2.1 不同方法测定花粉

28、活力的比较离体萌发法是根据花粉离体培养时的萌发率判定其生活力，这种方法简单、结果直观，该方法几乎适合所有植物花粉生活力的测定，但当培养条件和培养液配方有差异时，测定结果相差悬殊35。加入硼酸的蔗糖培养基花粉萌发率显著大于不加硼酸的培养基，说明在离体培养时苦瓜花粉的萌发对硼的要求严格，因本研究只是初步研究，对于苦瓜花粉最适宜培养基配方还有待于进一步研究。但应该注意的是，花粉萌发率并不等同于花粉活力，因为具有萌发能力的花粉在其传粉后不一定能正常结实。一般认为离体萌发法是最能反映花粉的活力，在本研究中的结果表明，碘碘化钾染色法、TTC法、醋酸洋红染色法、无机酸法检测的花粉花粉活力的结果与离体萌发法所

29、得结果都存在着极显著地差异，说明这几种方法都不是合苦瓜花粉活力的快速检测。只有过氧化物酶染色法得出的结果与离体萌发一致。4.2.2 染色法检测花粉活力从方差分析中可以得出，本研究所用到的快速检测花粉活力的方法中过氧化物酶染色法适合苦瓜花粉生活力的快速检测。从染色效果、颜色的区分难度和花粉活力百分率来看过氧化物酶法都是其余四种法中最好的，其结果与离体萌发法相近，且染色效果最好。本研究考虑的因素较少，只能初步认为过氧化物酶染色法是适合苦瓜花粉活力快速检测的方法，研究还可以用FDA染色法、MTT染色法、P-苯二胺法对苦瓜花粉活力进行检测，找出更适宜苦瓜花粉生活力快速检测染色法。致谢本研究从选题、试验

30、设计、试验实施到论文撰写，都是在导师田丽波副教授的悉心指导下完成的，能成为她的弟子是我一生的荣幸。导师为人宽厚正直，待人诚恳，治学严谨，具有忘我的敬业精神和积极的人生态度，这些都将令我终生受益。在此衷心的向我的导师致以最崇高的敬意!同时感谢海南大学园艺园林学院设施实验室分别为我提供了试验材料和试验场地。还感谢吴胜利同学、任国华同学在实验过程中给予的帮助。感谢所有关心和支持我的老师、朋友和同学们!感谢我的父母多年来对我的教育、支持和鼓励!参考文献1 秦贺兰,贾宗锴,闫东艳.南非万寿菊温室栽培花粉活力和柱头可授性研究J.河北林业科技.2010.32 郭庆,王德斌,王定康等.海棠藤花粉活力的测定方法

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