艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究_图文

1、华中农业大学硕士学位论文艾蒿黄酮的提取分离纯化、结构鉴定及其抗氧化性研究姓名:吴娜申请学位级别:硕士专业:食品科学指导教师:孙智达20080601 华中农业人学2008届颂l:学位论义倍。用硫代巴比妥酸(TBA法测定艾蒿黄酮对小鼠红细胞溶血、小鼠肝组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化产物MDA生成的影响,结果表明艾蒿黄酮在O.510.0mg/mL浓度范围内可提高体外小鼠血清抗活性氧能力,能抑制小鼠红细胞溶血,抑制小鼠肝组织匀浆及肝线粒体MDA的生成和肝线粒体肿胀,说明艾蒿黄酮具有体外对小鼠细胞器、细胞的抗氧化作用。艾蒿黄酮的体内抗氧化实验表明,艾蒿黄酮对降低小鼠肝脏MDA含量有显著的作用;能提高小鼠血

2、清SOD活性;说明艾蒿黄酮具有一定的体内抗氧化作用。关键词艾蒿;黄酮;分离;鉴定;抗氧化 华中农业人学2008届硕Ij学位论义硫酸锂分析纯磷酸分析纯无水硫酸钠分析纯沈阳市试剂三厂中国药品生物制品检定所分析天平Sartorius Instruments Ltd.,Germany电子天平北京赛多利斯天平有限公司101.2型干燥箱上海市实验仪器总厂紫外光栅分光光度计752型上海分析仪器总厂70pH Meter Beckman.GermanyHeidolph旋转蒸发器Made in GermanyXL.1型箱式高温炉河南省鹤壁市热工仪表厂电热套上海予华仪器有限公司挥发油提取器上海岚虹玻璃仪器有限公司1

3、.2实验方法准确称耿每份样品2.5009,采用105。C干燥恒重法测定(食品分析,2002。准确称取每份样品2.5009,采用525干燥恒重法测定(食品分析,2002。准确称取每份样品10.0009,采用酸碱滴定法测定(食品分析,2002。准确称取每份样品5.0009,采用比色法测定(食品分析,2002。14艾蔷趟酮的提耿分离纯化、结构雅定及jC抗钒化件研究精确称取芦丁标准品O.0209,用95%乙醇超声溶解,并定容于100mL容量瓶中。准确吸取标准品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于25mL比色管中,加30%乙醇至6mL,加入lmL5%的NaN02,摇匀

4、后静置6min,再加入lmLlO%的AL(N033,摇匀后静置6min,再加入10mL4%的NaOH,加水至25mL 摇匀后静置15min,以第一支试管溶液为空白,用1cm比色皿,在510nm下分别测定不同浓度的芦丁的吸光度。即得标准曲线吸光度Y和浓度X的关系式:Y=0.446X-0.0105,R=0.9999。采用FolinfenCiocalteau法测定干燥艾叶中总多酚的含量(Singleton V L et a1., 1965。配制Folinfen.Ciocalteau试剂和20%饱和碳酸钠溶液。v:765nm处所测Abs;x:所测样品溶液的总多酚浓度(rng/L。华中农业人学2008届

5、坝Ij学位论文取0.2mL样品溶液,加入12mL水、lmLFC试剂,静置8min,加入3mL20%碳酸钠溶液,加水定容至20mL,摇荡,静置2h,在765nm处比色。按照上述标准曲线测定方法,测定其吸光值,并计算样品中总酚含量。总酚含量=CxVxn/(Wx1000x100%C:总多酚浓度,mg/L;V:溶液体积,mL;n:稀释倍数;W:取样量,mg。取509的艾蒿粉末,加入200mL水浸泡lOb,连接挥发油提取器,采用常规共水蒸馏法回流提取5h,收集挥发油,置冰箱中冷藏。最终提取挥发油的收油率约为0.57%。挥发油为黄褐色透明油状物,具有浓郁香味。2结果与分析表2-1艾蒿中主要化学成分含量测定

6、结果Tablet2-1Analysis of main nutrition elements and flavonoid percent3结论湖北武汉狮子山所产艾蒿黄酮含量较高,有较高的研究价值,所以确定为实验材料。 。仁中农业人学2008届硕l:学位论文818型Ph计OROINO Research,Inc752型紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂m70pH Meter Beckman,GermanyHeidolph旋转蒸发器Made in Germany恒温水浴锅浙江检测仪表厂1.2试验方法艾蒿黄酮(Flavonoids ofArtemisia argyi,简称FA含量的测定:采用硝酸铝-亚

7、硝酸钠.氢氧化钠比色法分析(刘志勤等,2004。准确称取干燥艾蒿粉术样品1.0009,料液比为1:15,在70C条件下提取一次,提取时间为180分钟,乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%。过滤,滤液用相应浓度的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即为样品溶液。准确称取干燥艾蒿粉末样品1.0009,用60%的乙醇,料液比为1:15,在70条件下提取一次,提取时间分别为60、120、180、240、300分钟。过滤,滤液用60%的乙醇定容至lOOmL,吸取1.0mL,此溶液即为样品溶液。准确称取干燥艾蒿粉末样品1.0009,用60%的乙醇,料液比为1:15,提取时间为180

8、分钟。提取温度分别为40、50、60、70、80。过滤,滤液用60%的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即为样品溶液。艾.苗黄酬的提取分离纯化、结构貉定发je抗钣化件:|Jf究准确称取干燥艾蒿粉术样品1.0009,用60%的乙醇,在80C条件下提取,每次提取时间为90分钟。提取次数分别为1、2、3、4、5次。过滤,滤液用60 %的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即为样品溶液。在单因素实验的基础上,选出影响艾蒿黄酮提取率的3个主要因素(提取温度、时间及乙醇浓度设计正交实验,进行优化组合,考察指标为:艾蒿黄酮提取液的吸光值。表3-1正交试验的因素和水平水平X1时f司(minX

9、2乙醇浓度(%X3温度(称取艾蒿干粉3009,以57%的乙醇,料液比为1:20,在73回流浸提3h,抽滤得艾蒿提取液,回收溶剂,浓缩之后的提取液黄酮含量为37.56mg/mL。将大孔树脂于95%乙醇中浸泡8h,然后用蒸馏水洗至无乙醇;再用5%HCl 溶液浸泡3h,用蒸馏水洗至流出水pH值为中性;然后用5%NaOH溶液浸泡3h,用蒸馏水沈至流出水pH值为中性。每次上样沈脱完毕后,先用2%HCl沈至无色及用蒸馏水洗至pH值为中性;再用2%NaOH洗至无色,最后用蒸馏水洗至pH值为中性。将浓度为37.56mg/mL的艾蒿提取浓缩液分别通过已预处理好的D一101、ADS.17、AB.8树脂柱,柱体积为

10、22mL,柱长度12cm,柱内直径1.3cm(按树脂体积算进行动态吸附。用I%FeCl3检查流出液,待反应呈阳性(检测显色时,表明有黄酮流出,树脂吸附达到饱和,停止上样,记录上柱量。吸附1小时后,树脂柱先用水沈至无色并用苯酚浓硫酸法检测至无糖,再用95%乙醇沈脱至沈脱液 仁中农业人学2008届硕Ij学位论义,一ee:一。O、:呻:一0e0C一0:芷一5,图3.8(B温度、乙醇浓度对提取的影响等高线图Fig.3-8(BContour map of the effects of extraction as a function of temperatureand ethanol concentra

11、tion在中心组合实验的基础上,经曲面拟合,由回归方程可以计算出提取的最佳工艺条件为:时间149.47min,乙醇浓度56.04%,温度72.12。艾蒿黄酮提取率理论值可达89%。为了检验拟合结果的可靠性,采用上述最佳条件进行验证实验,将最佳提取条件修正为时间149min,乙醇浓度56%,温度72,料液比l: 20,提取2次。重复3次取平均值,艾蒿黄酮提取率为91.2%,证明最佳提取条件的可靠性。2.3艾蒿黄酮的纯化表3.53种大孔树脂对艾蒿黄酮的吸附分离性能比较Table3-5Comparison of adsorbing and separating capability of six t

12、ypes of macroporous resin on Artemisia argyi flavonoids大孔树脂的吸附性能对黄酮的纯化影响很大,树脂的极性和空间结构(主要艾-篙竹酮的提取分离纯化、结构搭定及1e抗瓴化忡研究指孔径、比表面积及孔容等是影响吸附性能的重要因素。在所选择的3种大孔树脂中,D.101非极性,AB.8为弱极性,ADS.17为极性(冯涛等,2002。由表3-5可知,AB.8型大孔树脂分离纯化艾蒿总黄酮效果较好,总黄酮吸附量最高,回收率、吸附率最大,因为黄酮具有多酚结构和糖苷键,显弱极性,因而有利于弱极性树脂的吸附。Table3-6Effect of different

13、 loaded amount on the purification ofArtemisia argyi flavonoids by using AB一8type resin由表3.6可知,柱体积为22mL,4mL时上样达到饱和;上柱量为3mL时,黄酮回收率最高;但是上柱量4mL时,洗脱液中黄酮含量最大,回收率只匕L3mL略低。考虑到纯化效率,粗提液上样体积以4mL为宜(郑功源等,2003。图3.9淋洗液pH值对艾蒿黄酮纯化效果的影响F ig.39Influence of pH values of water on the purification of Artemisia argyiflav

14、onoids由图39可知水的pH值对纯化有影响,当pH值5时总黄酮回收率最高,以pH 值5的水洗效果最好。 艾筒黄酬的提取分离纯化、结构黪定及JL抗氧化性研究动态沈脱效果见图3-10。从沈脱曲线可以看出?4倍柱体积50%的乙醇就基本可将吸附在树脂上总黄酮沈脱下来,并且曲线出峰快。沈脱液用旋转蒸发器回收乙醇后,冷冻干燥,产品纯度达到69%。因此,用5倍柱体积50%乙醇沈脱效果很好(Yujie Fu et a1.,2007。表3-9大孔树脂使用次数考察Table3-9Using times of macroporous resin使川次数吸附率%83.5782.6180.9453.12由表3.9可

15、见,树脂重复使用3次后,总黄酮吸附率下降,故AB.8大孔树脂只宜重复使用3次。按照上述2.3条件采用相应4倍数的树脂柱,柱长度48cm,柱内直径5.2cm,将16mL浓度为37.56mg/mLl钓l艾蒿提取浓缩液按照上述纯化条件经过AB一8大孔树脂纯化,产品真空干燥后纯度达69%。2.4黄酮分离纯化结果与分析表3.10艾蒿黄酮纯化产物结果分析Table310Results and analysis of refined products of FA由表3.10分析可知,石油醚和J下丁醇萃取效果不是很好,乙酸乙酯萃取分离FA的效果十分明显,FA2黄酮含量达到78.28%。FA2经过葡聚糖凝胶纯化

16、后(FAS,黄酮含量达到99.16%。牛中农业人学2008届顾Ij学位论义3结论1研究表明,通过以上单因素实验,在中心组合实验基础上,通过响应面分析法得出了提取FA的最佳工艺组合:时间149min,乙醇浓度56%,温度72,料液比1:20,提取2次。在此最佳工艺组合下FA的平均提取率可达91.2%。2AB.8大孔树脂纯化艾蒿黄酮的最佳条件:(树脂柱长度48crn:柱内直径5.2cm;初始上样液黄酮含量为37.56mg/mL上样量为16mL,淋洗剂为pH4的蒸馏水,洗脱剂为pH4的50%乙醇,洗脱剂用量为5倍柱体积,树脂可以重复使用3次,产品真空干燥后FAl纯度达69.37%。3乙酸乙酯相(FA

17、2纯度达78.28%,得率为2.64%;FA2经过葡聚糖凝胶纯化后(FA8,黄酮含量达到99.16%,得率为1.89%。艾蔷赞酮的提取分离纯化、结构峪定及L抗瓴化惮研究第四章艾蒿黄酮的结构鉴定本文旨在采用UV、IR、HPLC、HPLC.ESI/MS等现代分离检测技术,研究艾蒿黄酮的聚合度,基本组成单元,链的连接方式等结构信息,进而对其进行结果鉴定。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器.材料:艾蒿黄酮(FA即第三章所得到的艾蒿黄酮的葡聚糖凝胶纯化物FAS。甲醇、乙酸为色谱纯,其余试剂为国产分析纯,水为去离子水。UV-1700紫外扫描仪SHIM ADZU同本岛津公司470FT-IR Thermo N

18、ICOLET NEXUS Varian230型高效液相色谱(PDA检测器Varian Co.,USA100系列液质联用仪Agilent Co.,USA Agilent1(DEl4915085DAD检测器1.2实验方法取一定量的艾蒿黄酮FAS样品,用甲醇溶解,浓度为0.01mg/mL,在紫外光谱仪上扫描,扫描波长.(200nm.500nm。艾蒿黄酮与溴化钾按2:100的比例混合,研磨压片,采用傅立叶变换红外光华中农业人学2008屙硕:学位论义谱仪分析。红外光谱条件如下:扫描频率:32times/s,扫描范围:4000.400cm一。采用Varian230型高效液相色谱仪(PDA检测器,Diamo

19、nsil C18 (4.6minxl50mmx5um色谱柱,检测波长360rim,柱温25.0C,进样量101.tL,流速1.0mL/min,流动相:A为1%乙酸/水;B为甲醇。沈脱梯度:0-5min, 20%.37%B:5-25min,37%一50%B;25-35rain,50%一60%B;3545min,60%.90%B: 45.50min,90%B;50.55min,90%.20%B;55.60min,20%B。对FAS进行分析,以溶剂B溶解样品进样(Ma Y L et a1.,2001o采用Aglient1100Series LC/MSD Trap液质联用色谱仪,配有二元梯度泵, DA

20、D检测器,柱温箱和自动进样器。Zorbax SB.C18色谱柱(150x2.1mm,51LLm,流速:0.2mL/min,进样量4.0uL,检测波长360nm。流动相:(A1%乙酸/水(B甲醇(Hughes et a1.2001。洗脱梯度:0.5min,20%.37%B;5-25min,37%.50%B; 25-35min,50%一60%B;35.45min,60%-90%B:45-50min,90%B;50-55min, 90%一20%B:55.60min,20%B。ESI方式离子化,采用负离子模式,雾化压力为20psi,干燥气体的流速为7.00mL/min,温度为325,毛细管电压为4Kv

21、;扫描范围:1001000m/z(Jian Hart et a1.,2007;Cuyckens et a1.,2002。 华中农业人学2008届顾lj学位论文2.3艾蒿黄酮的HPLC,HPLC.ESI/MS分析4030毫20102025Minutes图4.3Sephadex LH-20纯化物高效液相色谱图Fig.4-3HPLC chromatogram ofsephadex LH20extractions of FA图4_4FAS总离子流图BPC士AIIMS chromatogram of refmed products of FA Fig.4-4 华中农业人学2008届硕I:学位论义过对艾蒿

22、黄酮进行的HPLC、HPLC.ESI/MS色谱分析,得出艾蒿中含有多种黄酮,HPLC.MS进一步证实了艾蒿中含有以芹菜素、槲皮素、香叶木素为苷元的黄酮,与报道的相符。艾篙黄酬的提取分离多b化、结构搭定及lC抗瓴化十牛研究第五章艾蒿黄酮的抗氧化活性研究近年来,随着对传统合成抗氧化剂BHT,BHA,TBHQ等毒性问题的提出,天然抗氧化剂越来越受到食品饲料等行业的青睐,特别是植物源抗氧化剂因其具有来源广泛、提取率高、抗氧化性强、与机体亲和力强和安全性高等优点,使天然抗氧化剂的研究逐渐成为热点(Rene Torres et a1.,2006。其中最有研究价值的就是广泛存在于植物体的黄酮类化合物(黄酮醇

23、、异黄酮、黄酮、黄烷酮以及黄酮类化合物的前体物(酚酸和儿茶酸等(朱宇旌等,2006。黄酮类化合物具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗过敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并发症等多种生理活性与药理作用,而这些生理活性是以黄酮类化合物的抗氧化活性为基础的(赵雪梅等,2003。黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性,如清除超氧阴离子、羟基自由基和过氧自由基等,同时能显著提高超氧化物歧化酶(SOD和谷肤甘肽过氧化物酶(GSH.PX均等抗氧化酶的活性,对H202有明显的抑制效应(杨转琴等,2006。1材料与方法1.1材料、试剂与仪器艾蒿黄酮:即第三章所得到的两种不同类型的FA提取物(乙酸乙酯萃取物FA2、SephadexLH.20纯化物FAS。昆明种小鼠,雄性,清洁级,体重20_29。购自湖北省疾控中心。碘化钾分析纯上海化学试剂有限公司三氯甲烷分析纯上海化学试剂有限公司41 艾筒竹酮的提取分离乡U化、结构搭定及E抗锻化件研究1.2实验方法采用