肝星状细胞分离培养及鉴定的试验方案

1、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs分离培养及鉴定的试验方案 【试验原理】在用循环灌注法去除肝胶原组织后 , 根据 HSC 内含富含脂滴 , 密度较轻 , 它与 肝脏内其它细胞在不同密度的离心液中有不同的浮密度的原理 , 采用密度梯度离 心方法 (连续性和非连续性两种 使 HSC 存在于 一高度提纯的区带中而得以分离。 【试验动物】雄性清洁级 Sprague-Dawsey 大鼠 (购自浙江省实验动物中心 , 合格证号: , 体重 400500g, 常规饲料喂养 , 正常饮水 , 在分离 HSCs 前 2周每天 Vitamin A 以 200IU/100g灌胃。【试

2、剂与仪器 】主要试剂型胶原酶、链霉蛋白酶 (Pronase E、 Nycodenz 均为美国 Sigma 公司产 品 ,DNA 酶 I(Dnase I、 DMEM 培养干粉 (高糖型 为 Gibco 公司产品 , 鼠抗人 Desmin 抗体 SP 试剂盒为福州迈新生物工程公司产品 , 其它试剂均为国产分析纯试剂。 主要仪器设备蠕动恒流泵、超净工作台 (2台 、电子分析天平、超速低温离心机、二氧化 碳培养箱、多功能动物手术台等。【试验方法】1、肝星状细胞的分离制备1肝星状细胞的分离采用改良的 Friedman 方法 , 大鼠术前禁食 1216h, 自由 饮水。2用 1%戊巴比妥钠 40mg/kg

3、 腹腔内注射麻醉大鼠。3胸腹部皮肤消毒 , 移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔 , 分离下腔静 脉及门静脉 , 在门静脉距肝外 10mm 处用眼科剪斜形剪一小口 , 迅速插入自制 血管插管 , 结扎固定。4接通恒流蠕动泵 , 灌注预热 37的 D-Hank s 肝脏灌流液 , 剪开下腔静脉 , 此 时可见灌流液自下腔静脉流出 , 肝脏逐渐饱满 , 由紫红色逐渐变成淡黄白 色。5游离肝脏 , 保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。 将游离之肝脏置 于平皿中 , 灌注预热 37的含酶Hank s 液 I(含 0.05%的胶原酶、 0.1%链霉 蛋白酶溶液并调 PH 7.35,并将灌注系统进

4、液端放入平皿中 , 使流出的酶液 可进行循环灌流 , 可见肝脏变软无弹性 , 肝包膜下出现小液泡。6倒除灌流液 , 撕去肝脏外膜 , 撕碎或剪碎肝组织 , 加入预热 37的含酶HankS液 (含 0.05%的胶原酶、 0.02%链霉蛋白酶、 0.01%DNA 酶 I 溶液 并调 PH 7.35,再次消化 20min 。7经 200目滤网过滤 , 用磨锤轻轻研磨 , 并用 4的 Hank S 液冲冼。8将烧杯内细胞悬液分装入 2只 50 ml的刻度离心管 ,550r/min 离心 8min ;吸 除上清入 2只 50 ml的刻度离心管 ,1750 r/min 离心 8min 。去上清 , 用 4

5、的 HankS液冲冼重悬 ,2管合 1定容至 10 ml。9加入 20 ml的 18% Nycodenz,将细胞悬液分装入 6只 10 ml带盖的刻度离心管 中 , 每管液面覆盖 23 ml的HankS液 ,3200 r/min 离心 15 min。吸取中间 细胞悬液层入 50 ml刻度离心管 , 加入无血清 DMEM 培养液至 50 ml,550 r/min 离心 8 min,取沉淀。10 加入预热 37的含血清的 DMEM 完全培养基至 10ml 。2、 肝星状细胞的鉴定1 光镜下观察新分离的肝星状细胞含有丰富的脂滴 , 细胞透光度增加。2 维生素 A 自发荧光鉴定:荧光显微镜下观察 ,

6、在 328 Bin 波长的紫外光激发下 , 新分离的肝星状细胞能发出蓝绿色的自发荧光 , 但在数秒内迅速减退。3 新鲜肝星状细胞产量测定倒置相差显微镜下 , 使用血细胞计数板计数肝星状 细胞产量。4肝星状细胞活力的鉴定常规台盼蓝拒染法5 免疫组织化学 (简称免疫组化 法鉴定 Desmin 阳性的细胞:用鼠抗人 Desmin 抗体 ,SP 法做免疫细胞化学染色。3、肝星状细胞纯度的鉴定:倒置显微镜下于细胞片上随机数 200个细胞 , 计数 Desmin 染色胞浆黄色的细胞 , 并计算纯度。肝星状细胞纯度 (%=Desmin阳性的细胞/细胞总数100%。 4、肝星状细胞的培养1原代培养用含 20%

7、(体积分数 胎牛血清的 DMEM 完全培养基稀释细胞悬液 , 留取少量的 细胞进行细胞纯度及活力鉴定。以 11051 106ml 的密度接种到 50ml 塑料培 养瓶中 , 在 37、体积分数为 5%co :、 95%潮湿空气的 C02恒温培养箱里培养。 培养瓶内细胞 24 h后首次换新鲜 DMEM 培养液 , 以后每 3 d换液 1次 , 培养液改为含10%胎牛血清的 DMEM 完全培养基。2传代培养原代培养星状细胞长满单层后 , 吸去培养基 ,0. 25%胰蛋白酶于 37消化 1015 min。等细胞附着松动 , 显微镜下观察细胞质边缘卷起 , 间隔加大 , 便终止 消化。吸去胰蛋白酶 , 用 Hanks 液清洗 1次。加入 3 ml DMEM,反复吹打培养瓶壁制 成单个细胞悬液 , 收集细胞悬液 ,1 500 r min 离心 10 min, 离心 2次后加入含 10%胎牛血清的 DMEM 重悬 , 以 2 X 105个 /ml 浓度。注意事项(1灌注速度要恒定在 10ml/min,防止血栓的形成,影响以后的消化。(2灌注液的 PH 要准确控制在 PH 7