丁洁振荡纯化

1、哈尔滨商业大学毕业设计（论文）菜豆皂苷大孔树脂振荡纯化工艺的研究学 生 姓 名 丁洁 指 导 教 师 李笑梅 专 业 食品质量与安全 学 院食品工程学院 2009年06月12日Graduation Project (Thesis)HarbinUniversity of CommerceStudy on the Technology of oscillationPurification of Saponin of the Bean Student Ding JieSupervisor Li XiaomeiSpecialtyFood QuaLity and SafetySchoolHarbinUn

2、iversity of Commerce2009-06-12毕业设计（论文）任务书姓名 丁洁学院 食品工程学院班级 05一班专业 食品质量与安全毕业设计（论文）题目：菜豆皂苷大孔树脂振荡纯化工艺的研究立题目的和意义：菜豆是人们日常生活中深受欢迎的蔬菜，其皂苷含量又很高。皂苷是一类具有多种生理功能的活性物质，如降血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、免疫调节、抗菌抗病毒等作用。从化学结构上分，三萜类皂苷如人参皂苷、大豆皂苷、柴胡皂苷、甘草皂苷、桔梗皂苷、远志皂苷、商陆皂苷、木通皂苷、酸枣仁皂苷等具有降低胆固醇、抗炎、抑制肿瘤、免疫、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子与软体动物等作用。甾体皂苷如

3、沿阶草皂苷、知母皂苷等则显示有抗肿瘤、抗真菌和细菌以及降低胆固醇的作用。本文通过对菜豆皂苷超声波提取法与振荡纯化工艺的研究，既节约时间和实验试剂，也为进一步研究菜豆皂甙化学组成、结构分析、生物活性评价及中毒机理作用奠定基础。以用来预防、缓解、控制豆角中毒上升，从食品原料上消除安全隐患，对预防菜豆中毒有重要的理论意义。技术要求与工作计划：技术要求以菜豆为原料，采用超声波-乙醇提取法从中提取粗皂苷化合物，通过单因素实验选择适宜的超声波提取条件，利用大孔树脂对粗皂苷化合物进行振荡纯化并通过单因素和正交试验确定最佳的纯化工艺，以泡沫试验和溶血试验定性，以香草醛-冰醋酸比色定量，以提取液和解吸液的颜色变

4、化程度评价大孔树脂振荡纯化效果，在此基础上计算皂苷的得率，为菜豆皂苷的进一步研究和广泛应用提供理论依据。工作计划:1.菜豆皂苷提取方法选择利用乙醇对菜豆中总皂苷进行初步提取并用乙醚除杂，确定最佳的乙醚除脂肪的时间。2. 菜豆皂苷的定性定量运用泡沫实验和溶血实验对粗提液进行定性，再通过香草醛-冰醋酸比色法进行定量3.不同因素对菜豆皂苷纯化效果的影响通过单因素试验确定影响菜豆皂苷纯化效果的主要因素。4.最佳纯化工艺条件的确定通过正交试验确定最佳的纯化工艺。时间安排：1. 2009.03.01 至2009.03.23 查阅文献及相关资料2. 2009.03.24 至2009.03.30 整理相关信息

5、并汇总，准备实验仪器，配制相关实验试剂，实验材料采集3. 2009.03.31 至2009.04.06 撰写开题报告，进行前期实验4. 2009.04.07 至2009.04.13 进行皂苷提取实验并熟悉流程、记录5. 2009.04.14 至2009.05.04 进行皂苷去毒单因素实验，记录6. 2009.05.05 至2009.05.11 进行皂苷去毒正交试验，优选出最佳工艺条件7. 2009.05.12 至2009.05.20 数据整理及结论讨论8. 2009.05.21 至2009.05.31 撰写论文92 后期修改润色，准备答辩指导教师要求：（签字） 年 月 日教研室主任意见：（签字

6、） 年 月 日院长意见；（签字） 年 月 日毕业设计（论文）审阅评语一、指导教师评语：指导教师签字：年 月 日毕业设计（论文）审阅评语二、评阅人评语：评阅人签字：年 月 日毕业设计（论文）答辩评语三、答辩委员会评语：四、毕业设计（论文）成绩：专业答辩组负责人签字： 年 月 日五、答辩委员会主任单位： （签章） 答辩委员会主任职称：答辩委员会主任签字：年 月 日摘要以菜豆为原料，采用超声波-乙醇法提取菜豆皂苷，对大孔树脂振荡纯化技术进行研究。选取大孔树脂的吸附时间、大孔树脂用量、乙醇洗脱浓度和乙醇洗脱用量四个影响因素进行单因素实验，在此基础上进行正交试验，以皂苷纯化得率和溶血程度为评价指标，确定

7、最佳纯化条件为：大孔树脂用量6g，大孔树脂吸附时间20min，乙醇洗脱浓度80%，乙醇用量60mL。在此最佳条件下皂苷纯化得率为0.610mg·g-1（以新鲜菜豆计）。关键词：菜豆皂苷；溶血；纯化；大孔树脂AbstractTaking the kidney bean as raw material,extract the bean saponin by ultrasonic and ethanol,the study is about technique of macroporous resin oscillationt purification of kidney bean-sap

8、onins.On the basis of having seleted ethanol consumption,concentration of ethanol,adsorption time of Macroporous resin and the amount of macroporous as four influence factors to conduct single-factor tests,the orthogonal experiments have been carried out,based on the evaluation indexes of saponins.P

9、urification rate and the hemolysis degree,which Lead to the determination of the optimum detoxicated conditions,namely ethanol consumption 60mL,concentration of 80% ethanol,adsorption time of Macroporous resin 20min,the amount of macroporous 6g.Purification rate of saponins is 0.610mg·g-1.Key W

10、ords：bean saponins;oscillation;purification;hemolytic;macroporous resin目 录摘要IAbstractII1绪论11.1皂苷的综述11.1.1皂苷的定义和分类11.1.2皂苷的理化性质21.1.3皂苷的生理功能21.2皂苷的研究现状4 皂苷的定性分析41.2.2 皂苷的定量分析41.2.3 皂苷提取技术的研究51.2.4 皂苷纯化的研究51.2.5皂苷的应用及前景展望61.3立题依据、研究目的和研究意义62实验部分72.1 实验仪器72.2 实验材料72.2.1试剂72.2.2 样品82.3实验方法与内容82.3.1 菜豆粗皂

11、苷提取工艺流程研究82.3.2 菜豆皂苷的定性定量方法92.3.3 纯化操作流程122.3.4振荡纯化单因素实验122.3.5 最佳纯化条件的研究133结果与讨论143.1菜豆粗皂苷提取工艺流程研究结果143.2 菜豆粗皂苷振荡纯化工艺流程研究结果14大孔树脂振荡纯化前后比较结果14大孔树脂振荡纯化效果的比较153.2.3 大孔树脂振荡纯化与层析纯化比较结果153.3 单因素实验结果163.3.1大孔树脂吸附时间对纯化效果的影响163.3.2大孔树脂用量对纯化效果的影响163.3.3乙醇浓度对纯化效果的影响173.3.4乙醇用量对纯化效果的影响183.4 正交试验测定的结果183.4.1振荡纯

12、化最优条件的研究结果183.4.2实验结果显著性分析20结 论21参考文献22致谢231 绪 论1.1 皂苷的综述1.1.1 皂苷的定义和分类皂甙是一类复杂的化合物，它的水溶液振荡时能产生大量的持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似，故名皂甙1。皂苷(saponins)是由皂苷元(sapogenins) 和糖、糖醛酸或其他有机酸组成的，存在于植物界的一类较复杂的甙类化合物。据中药大辞典载:荚果含三帖皂甙、鞣质，此外，还含蜡醇、廿九烷、亚甾醇、谷甾醇等，含皂苷的植物颇多，至少有50 个不同科的400 种植物含有之1,2。皂苷大多数是螺甾烷及其生源相似的甾族化合物的低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖苷，按其结构

13、可分为两种1,2：1.1.1.1 甾式皂苷（Steroid saponins）皂苷元为甾体衍生物，具27个碳原子。不具羧基，故又称中性皂苷。在碱性溶液中形成较稳定的泡沫，能被碱式醋酸铅试剂沉淀。本类皂苷主要存在于薯蓣科、百合科植物中，如各种薯蓣、七叶一枝花、土茯苓、知母、麦冬等，它们都是制药工业中的重要原料。甾式皂苷因可作为合成甾体激素的原料而有重要意义。其甙元基本骨架为螺旋甾烷（Spirostane）。1.1.1.2 三萜式皂苷（Triterpenoid saponins）皂苷元为三萜类衍生物，具30个碳原子。大多数在甙元上带有羧基，故又称酸性皂苷。在酸性溶液中形成较稳定的泡沫，能被醋酸铅试

14、剂沉淀。本类皂苷在植物界分布较广，尤以石竹科、桔梗科、五加科、豆科等为多。桔梗、南沙参、党参、人参、三七、瞿麦、甘草、远志、紫菀、地榆等许多中草药都含有本类皂苷。其甙元有五环三萜与四环三萜二种，五环三萜又可分为下面四种类型：(1) 齐墩果烷型(-香树脂烷型，-amyrane)；(2) 乌苏烷型(-香树脂烷型，-amyrane)；(3) 羽扇豆烷型(Lupane)；(4) 木栓烷型；四环三萜类皂苷可分为这几个主要类型：(1) 达玛烷型；(2) 羊毛脂甾烷型；(3) 甘遂烷型；(4) 环阿炖烷型；(5) 葫芦烷型；(6) 楝烷型；1.1.2 皂苷的理化性质1.1.2.1 物理性状 皂苷的分子量较大

15、，不易结晶，大多为白色或乳白色的无定形粉末，成的皂苷元为结晶状物质，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂。1.1.2.2 溶解性 大多数皂苷极性较大可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不溶于乙醚、苯等极性小的有机溶剂。皂苷易溶于水饱和的丁醇或戊醇中，因此常从水溶液中用丁醇或戊醇提取，借以与糖、蛋白质等亲水性成分分开。皂苷经酶或酸水解生成的皂苷元为结晶状物质，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂。1.1.2.3 起泡性皂苷有去污作用，因其具有表面活性剂的作用，能降低水溶液表面张力，皂苷水溶液经强烈震荡能产生持久性的泡沫，且不因加热而消失。1.1.2.4 溶血性 皂苷与血液接触后能破坏红血球，产生溶血现

16、象。1.1.2.5 与酸作用 皂苷在无水条件下，与强酸(硫酸等)、中等强酸(三氯乙酸)或LewiS酸(氯化锌)作用，会产生颜色变化或荧光。1.1.2.6 与其它试剂的作用8皂苷的水溶液遇醋酸铅或碱式醋酸铅试剂可产生沉淀。1.1.3 皂苷的生理功能皂苷是一类具有多种生理功能的活性物质，如降血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、免疫调节、抗菌抗病毒等作用6。从化学结构上分，三萜类皂苷如人参皂苷、大豆皂苷、柴胡皂试、甘草皂苷、桔梗皂苷、远志皂苷、商陆皂苷、木通皂苷、酸枣仁皂苷等具有降低胆固醇、抗炎、抑制肿瘤、免疫、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子与软体动物等作用。甾体皂苷如沿阶草皂苷、知母皂苷等

17、则显示有抗肿瘤、抗真菌和细菌以及降低胆固醇的作用。1.1.3.1 抑制肿癌细胞生长的抗肿瘤作用如葛根总皂苷对白血病的抑制作用，绞股兰总皂苷(GP)对肉瘤有明显抑制作用，存在金银花(AnneLnoeraddenaa)中的三萜皂苷有显著的消肿作用并能抑制腹水性肝癌的生长。人参皂苷、绞股蓝皂苷、辽东穗木中皂苷类化合物、玄参科全草中的总皂苷、白头翁皂苷、毛莫科植物中的皂苷都是经过多次试验证明了的抗癌药物。1.1.3.2 调节脂质代谢，防止心血管疾病和降胆固醇的作用 人参皂苷Rg1在治疗动脉粥样硬化和血栓形成方面具有显著的疗效，绞股蓝皂苷对氧自由基所致脑血管痉挛有保护作用，桔梗总皂苷对高血脂有降低作用。

18、大豆皂苷1,2,6,7,8可以抑制血清中脂类的氧化，抑制过氧化酯质的生成，并能降低血中胆固醇和甘油三脂的含量。1.1.3.3 滋补强壮，提高免疫力作用甘草皂苷能破坏血管内的爱滋病细胞，对人的免疫缺陷病毒(HW)具有抑制增殖的效果。酸枣仁皂苷具安神补脑的作用。大豆皂苷具有减肥作用，还能抑制爱滋病毒的感染。1.1.3.4 抗菌消炎、抗病毒作用 据中国应用药理学记载：皂苷具有广谱抗菌作用；它对溶血性金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、百日咳杆菌及其常见的致病性皮肤真菌均具较强的抑制作用。如：从山茶叶中分离的三萜皂苷和已用作

19、杀菌药，从云南白药中提取的皂苷对小鼠的实验性炎症有抑制作用。青叶胆皂苷具抗肝炎作用，柴胡皂苷具清热解毒作用，皂荚皂苷具镇咳消炎作用。 1.1.3.5 杀虫作用-番茄碱、垂茄碱等生物碱类皂苷及其衍生物，对白蚁的食饵有忌避作用14。皂苷对用鳃呼吸的动物和软体动物、鱼类显示有很强的毒性抗菌消炎、抗病毒作用。1.1.3.6 抗生育作用 柳叶牛膝中的总皂苷及十蕊商陆中分出的皂苷均有杀灭精子作用。1.1.3.7 其它方面活性 除上述活性外，皂苷还表现多方面活性如土贝母皂苷具有治疗疣症作用，重楼排草皂苷的子宫兴奋作用，合允总皂苷的抗子宫外孕作用，桔梗皂苷对中枢神经系统有抑制作用，并具镇咳、镇痛和解热作用，对

20、消化性溃疡有预防和促进治疗作用等等。大豆皂苷可抑制血小板和血纤维素蛋白原的减少，也可抑制凝血酶引起的血栓纤维蛋白形成，表明其具有抗血栓作用。1.2 皂苷的研究现状皂苷的各种理化性质可作为其定性定量的依据。1.2.1 皂苷的定性分析1.2.1.1. 泡沫反应利用皂苷的表面活性作用，是检查皂苷存在的经典方法。1.2.1.2. 显色反应(1) 浓硫酸实验在皂苷提取液中加少量浓硫酸，若产生红色紫红色紫蓝色蓝绿色颜色变化，则说明皂苷提取液含有皂苷。(2) Liebermann-Burchard(醋酐-浓硫酸)反应将少量皂苷样品溶解于醋酸中，加入浓硫酸一醋酐(1:20)试剂，呈黄红蓝紫绿颜色变化。甾体皂苷

21、最后显绿色，而三萜皂苷转变成红色或紫色，不显绿色。此法可用来区别甾体皂苷和三萜皂苷。(3) 三氯乙酸反应将皂苷的氯仿溶液滴在滤纸上，加三氯乙酸试剂1滴，加热至60，显红色，渐变为紫色者为甾体皂苷，而加热到100，发生上述颜色变化者为三萜皂苷8。1.2.1.3. 溶血实验利用皂苷的溶血毒性做的定性实验。一般为试管检验法、涂片显微镜检验法、滤纸喷洒检验法三种。1.2.2 定量分析皂苷的定量是皂苷研究利用中的最大难题。皂苷本身没有紫外吸收，无专一性显色剂,直接测定的难度很大。以不同的测定方法得到的皂苷的含量相差很大。经有关专家的多年研究，皂苷总量现可用重量法、比色法或溶血指数法测定。其中溶血指数法较

22、方便，但其结果受条件（如试管大小、溶液pH、温度、血液种类等）影响较大，故不够精确。比色法一般为香草醛-高氯酸显色法。浓硫酸、高氯酸、高氯酸-香草醛、浓硫酸-香草醛等的显色原理主要是使羧基脱水，增加双键结构，再经双键位移，双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形成阳碳离子盐而显色。三萜皂苷类成分多在5%香草醛冰醋酸-高氯酸反应中显色，因此5%香草醛冰醋酸-高氯酸反应被广泛地应用于三萜皂苷类成分的含量测定，如人参皂苷、三七皂苷、远志皂苷、大豆皂苷等10,11。1.2.3 皂苷提取技术的研究常见的皂甙提取方法，通常有三类，即水浸法、吸附法和有机溶剂提取法8。水浸法主要是将原料破碎用水浸出，

23、然后澄清、过滤、浓缩，得皂甙粗品。其生产工艺，生产设备简单，处理样品量大，但产品纯度低，能耗大，渣处理困难。吸附法是用水或溶剂浸提原料，用无机物或有机树脂吸附杂质，浓缩得成品。有机溶剂提取法主要是醇提法。它分为甲醇和乙醇浸提两种。出于食品安全角度考虑，常应用乙醇作为提取剂16,20,21。1.2.4 皂甙纯化的研究1.2.4.1 高效液相层析国外己普遍应用高效液相层析分离结构相似的皂甙。1.2.4.2 反相柱层析近年来在皂甙的分离上，除继续使用正相硅胶柱外，使用反相硅烷化硅胶多孔性树脂的例子日渐增多。1.2.4.3 液滴逆流层析法液滴逆流层析是基于化合物在两种互不混溶的液相中分配差异进行分离，

24、对溶剂系统有一定限制，要求在短时间内分离成两相，并能有效地形成液滴。1.2.4.4 闪柱层析闪柱层析的特点是层析柱短，采用球型硅胶且加压而使洗脱速度快，因此分离周期短，溶剂所需量少，且有较好的分离效果。1.2.4.5 离心板层析离心板层析是一种全程分离方法，对结构相似皂甙的分离特别有效。1.2.4.6 大孔树脂吸附树脂法大孔树脂吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，具网状结构和很高的比表面积。与离子交换树脂分离原理不同，它本身有的吸附性是由范德华引力或产生氢键的结果，筛性原理则是由于其本身多孔性结构所决定的，是一种吸附性与筛选性原理相结合的分离材料。常用型号有: D-101 ,D-201

25、 , MD-05271 , CAD-40 ，AT3-8等，特点是吸附容量大、再生简单、效果可靠，尤其适用于甙类、黄酮类、皂甙类、生物碱类等成分的提取分离及大规模生产。大孔树脂17对皂甙的纯化不但可以去除粗提液的颜色，产品呈现粉末状，而且操作简便，成本较低，回收率大，适于工业化生产。非极性树脂如 D-101 型，适用范围比较广泛。对于不带极性的有机化合物，普遍吸附能力强，特别对皂甙类分离,纯化效果尤佳，对黄酮类也很适宜，如人参皂甙、三七皂甙、薯蓣皂甙、银杏黄酮等。D-101 型大孔树脂吸附树脂经二十多年的提取物生产应用实践证实，该产品对植物水溶性物质分离，纯化行之有效。工艺简单，易于操作,技术成

26、熟，产品质量稳定，安全可靠是分离、纯化中药提取液的理想品牌18。1.2.5 皂苷的应用及前景展望皂甙由于其特有的物理化学性质和生理功能，在农业、食品行业、医药行业和化妆品行业有着很大的应用价值。在国外已经有很多皂甙的制品销售，取得了很好的经济效益和社会效益。然而，由于皂苷提取工艺的复杂，使得实现皂苷制品大批量的工业化生产，一直是人们研究的方向。相信在未来的研究中，随着质量的加强和应用规律的进一步掌握，皂苷的研究必将进入一个更深入的领域，同时也将产生良好的社会效益和经济效益大。1.3 立题依据、研究目的和研究意义菜豆是人们日常生活中深受欢迎的蔬菜，其皂苷含量又很高。皂苷是一类具有多种生理功能的活

27、性物质，如降血脂、抗氧化、抗动脉粥样硬化、免疫调节、抗菌抗病毒等作用。从化学结构上分，三萜类皂苷如人参皂苷、大豆皂苷、柴胡皂试、甘草皂苷、桔梗皂苷、远志皂苷、商陆皂苷、木通皂苷、酸枣仁皂苷等具有降低胆固醇、抗炎、抑制肿瘤、免疫、兴奋或抑制中枢神经、抑制胃液分泌以及杀死精子与软体动物等作用。甾体皂苷如沿阶草皂苷、知母皂苷等则显示有抗肿瘤、抗真菌和细菌以及降低胆固醇的作用。 本文通过对菜豆皂苷超声波提取法与简便纯化工艺的研究，既节约时间和实验试剂，也为进一步研究菜豆皂甙化学组成、结构分析、生物活性评价及中毒机理作用奠定基础。以用来预防、缓解、控制豆角中毒上升，从食品原料上消除安全隐患，对预防菜豆中

28、毒有重要的理论意义。2 实验部分2.1 实验仪器分析天平TG238型北京赛多利斯仪器系统有限公司多功能食物搅拌器SJ260C顺德市兰谱电器制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9123A上海一恒科学仪器有限公司双频数控超声波清洗器KQ-500VDE昆山市超声仪器有限公司数控恒温水浴锅XXXTD上海申胜生物技术有限公司旋转蒸发仪R-205上海申胜生物技术有限公司循环水式真空泵SHZ-D（）巩义市予华仪器责任有限公司数显恒温水浴锅MTD余姚市东方电工仪器厂分光光度计722型上海精密科学仪器有限公司2.2 实验材料2.2.1 试剂乙醇 分析纯 天津市化学试剂三厂乙醚 分析纯 天津市鑫铂特华工有限公司

29、盐酸 分析纯 天津市泰兴化学试剂厂高氯酸 化学纯 沈阳市东兴试剂厂冰醋酸 化学纯 天津市泰兴化学试剂厂香草醛 化学纯 遵义市第二化工厂人参皂苷Rg1 标准试剂 吉林省宏久生物科技股份有限公司氯化钠分析纯天津石英钟厂霸州市化工分厂氢氧化钠分析纯天津市富禄化工试剂厂柠檬酸分析纯天津市化学试剂一厂柠檬酸纳分析纯天津市化学试剂一厂磷酸二氢纳分析纯天津市化学试剂三厂磷酸氢二纳分析纯天津市化学试剂三厂大孔树脂 D101 天津汇达化工有限公司样品菜豆 将军豆 哈尔滨民安小市场采购人血 O型血 血站提供2.3 实验内容与方法2.3.1 菜豆粗皂苷提取工艺流程研究经典正丁醇提取法操作流程如下： 搅碎新 鲜 菜

30、豆乙醇浸提过 滤菜 豆 匀 浆滤液减压浓缩加水溶解石油醚萃取（三次）弃去醚层加 水 定 容干浸膏干浸膏减 压 浓 缩正丁醇萃取（三次）保留水层弃去水层保留正丁醇层定 量超声波-乙醇提取法操作流程如下：待纯化液干浸膏加水溶解减 压 浓 缩超声波-乙醇浸提弃去醚层新鲜菜豆菜豆匀浆绞碎乙醚除脂肪烘 箱 烘 干(1) 菜豆需要经过预处理：清除菜豆表面泥土、草屑等杂质，称取30kg菜豆样品，放入多功能食物搅拌器匀浆化。(2) 将菜豆匀浆放入恒温烘干箱,在50下烘干后，用多功能搅拌机将其磨成2583g菜豆粉。(3) 菜豆粉每次取样量60g。(4) 乙醚萃取后的醚层弃去。(5) 醇提时的乙醇溶液浓度为75%

31、，加入量为100 mL，超声波提取时间为40min,功率为400w，频率为80Hz，水浴温度不得超过50。(6) 真空浓缩时的溶液温度保持在60以下，因高温浓缩会使成品颜色变深,真空浓缩并控制温度可以减少在浓缩过程中溶液中的物质发生不必要的变化。(7) 真空浓缩的干浸膏加水溶解，备用。2.3.2 菜豆皂苷的定性定量方法2.3.2.1 红细胞悬液的配制(1) 阿氏液的配制（ALsevers液）葡萄糖2.05g柠檬酸钠 (Na9C6H5O7·2H2O)0.89g柠檬酸 (C6H 6O7·H2O)0.05g氯化钠  0.42g蒸馏水100mL调pH 至7.2，过滤灭菌或

32、高压灭菌10min，置4冰箱保存。阿氏液中含有抗凝集的成分，可以保证血细胞在保存状态下为溶液状态，用阿氏液进行保存的红细胞一般可以保质一到两周。(2) 0.85%氯化钠溶液的配制使用电子天平准确称取8.5g的氯化钠固体粉末，用蒸馏水溶解，定容至1000毫升，保存备用。(3) 5%人红细胞悬液的制备红细胞制备：取人血5mL（防止污染），放入盛有20mL ALsevers 液瓶中，即人血和阿氏液的比例为1:4，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。红细胞悬液制备：取用ALsevers 液保存的新鲜人血5mL，加入8mL 的0.85 的氯化钠溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此重

33、复操作洗涤3-5次，至上清液颜色近乎透明后,按照离心出的红细胞体积配成5%的人血红细胞悬液，4保存备用。操作均应在无菌操作台进行，操作过程中注意用酒精灯灭菌，操作范围不要偏离酒精灯范围，以保证红细胞不被污染；还应注意的是，操作中振摇动作不宜过大，以免造成红细胞破损，影响实验结果。(4) 人参皂苷标液配置菜豆皂苷目前国内还没有标准品，人参皂苷Rg1具有溶血作用，所以标准样品选择人参皂苷Rg1。用生理盐水将人参皂苷Rg1配制成浓度为1mg/mL的标准溶液，用于溶血试验。另用甲醇将人参皂苷Rg1配制成浓度为0.5 mg/mL的标准溶液，用于标准曲线的绘制。2.3.2.2 定性分析(1) 泡沫实验分别

34、吸取浓度为1 mg/mL人参皂苷Rg1标准溶液5 mL和5 mL菜豆提取液，放入试管中剧烈振摇，看其是否产生蜂窝状泡沫以及记录泡沫持续不灭的时间，并将试验管与标准管比较，用以判定有无皂苷。(2) 溶血实验采用试管实验法：分别吸取浓度为1 mg/mL人参皂苷Rg1标准溶液1 mL（加入4 mL生理盐水），菜豆粗提取液，生理盐水，自来水各5mL，放入试管中，分别加5% 红细胞悬浮液1 mL及生理盐水2 mL摇匀。观察红细胞的溶血现象，同时以红细胞悬液作为阴性对照，加自来水的试管样作为阳性对照。采用肉眼观察若液体澄清透明, 为高度溶血()；液体有些浑浊，有较少的红细胞，为中度溶血()；液体混浊,仔细

35、观察可看到液体中较多的红细胞，为轻度溶血()；液体与对照组相似，血细胞分布较均匀，为不溶血()。注：检液应为中性溶液，如不是中性溶液，应调节相应的酸碱度，并作溶血对照样。2.3.2.3 定量分析一般豆类皂苷的含水乙醇提取物中能干扰皂苷比色测定的主要物质是可溶性糖、油脂和酚式化合物，如果直接取样测定吸光度，计算皂苷的含量将很高。据资料显示，选用高氯酸显色体系做豆类皂苷的比色法测定的干扰要小，含油的样品必需脱脂后才能测定。高氯酸显色法对于皂苷是非特异性的，最好在测定前对样品作简单的除杂11,12。(1) 人参皂苷Rg1标准曲线的绘制精密吸取上述标准溶液（浓度0.532 mg/mL）0.05、0.1

36、0、0.15、0.20、0.25、0.30 mL分别置于具塞试管中，水浴挥去溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，在60水浴中加热15 min，流水冷却10 min，加冰乙酸5 mL，摇匀静置，在15 min内于波长540 nm处分别测吸光度A。另吸取蒸馏水0.10 mL于具塞试管中，以下各步同于上述操作，此管溶液为参比溶液。经计算得标准曲线的一元线性方程为：y = 2.4415x 0.0495，r2=0.9864，表明相关关系存在。以人参皂苷Rg1的质量(mg·mL-1)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，见图2-1。图2-1 人参皂苷标

37、准曲线(2) 皂苷含量的测定吸取定容的皂苷粗提液0.1 mL于具塞试管中，在60水浴中挥去溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL。在60水浴中加热15 min，流水冷却10 min，加冰乙酸5 mL，摇匀静置，在15 min内于波长540 nm处测吸光度 。同时吸取0.1mL的蒸馏水于具塞试管中，其他操作同上。根据方程计算测定用液皂苷量为：皂苷量/ mg =2.4415x 0.0495以香草醛-冰乙酸比色法测得的A值，计算出新鲜菜豆皂苷得率，计算公式为：mm样×皂苷得率/ mg ·g-1f×V1V2式中： m 由回归方程计算得到的

38、皂苷质量，mg； m样 菜豆干粉取样量，g；V1 菜豆粗皂苷试液定容体积，50 mL；V2 测定用液体积，0.1 mL；f 菜豆的干粉率，即菜豆干粉与新鲜菜豆的质量比，8.61%；2.3.2.4 大孔树脂的预处理(1) 预处理的目的为了保证制剂最后用药安全。树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。(2) 预处理的方法无水乙醇浸泡24h用水洗至无醇味5%HCl通过树脂柱，浸泡2-4h水洗至中性2%NaOH通过树脂柱，浸泡2-4h水洗至中性，备用。2.3.2.5 评价指标以泡沫实验定性、溶血反应鉴定溶血活性、皂苷得率定量、脱色程度评价纯化效果。2.3.3 纯化操作流程大孔树脂

39、吸附过滤待纯化液乙醇洗脱滤 液减压浓缩干 浸 膏过滤定 量定 容加 水 溶 解(1) 加入大孔树脂吸附后用水冲洗三次，过滤，弃去废液。(2) 乙醇洗脱后真空浓缩，干浸膏加水溶解定容到50 mL的容量瓶中。(3) 60水浴锅蒸干，香草醛-冰氯酸比色定量。2.3.4 振荡纯化技术单因素实验影响纯化效果的因素一般有大孔树脂用量、大孔树脂吸附时间、乙醇浓度、乙醇用量、洗脱次数等，根据实验条件和相关资料选择了大孔树脂用量、大孔树脂吸附时间、乙醇浓度、乙醇用量四个因素及不同水平对菜豆粗皂苷试液进行单因素研究。以此皂苷得率和溶血程度为指标，从中筛选出较优的水平进行下一步正交试验。2.3.4.1 大孔树脂吸附

40、时间与纯化效果的关系在大孔树脂用量6g，乙醇浓度75%，乙醇用量50mL条件下，进行大孔树脂吸附时间实验，大孔树脂吸附时间10min、15min、20min、25min、30min。吸附过程要搅拌。2.3.4.2 大孔树脂用量与纯化效果的关系在大孔树脂吸附时间20min，乙醇浓度75%，乙醇用量50mL条件下，进行大孔树脂用量实验，大孔树脂用量分别为3g、4.5g、6g、7.5g、9g。2.3.4.3 乙醇浓度与纯化效果的关系在大孔树脂吸附时间20min，大孔树脂用量6g，乙醇用量50mL条件下，进行乙醇浓度实验，乙醇浓度分别为70%、75%、80%、8.5%、90%。2.3.4.4 乙醇用量

41、与纯化效果的关系在大孔树脂吸附时间20min，大孔树脂用量6g，乙醇浓度75%条件下，进行乙醇用量实验，乙醇用量分别为40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL。2.3.5 振荡纯化最优条件的研究根据单因素实验的结果，选取对菜豆皂苷纯化效果影响的主要因素水平，以溶血程度及得率为评价指标，选用正交设计表L9(34)安排实验，见表2-1。表2-1L9(34)正交设计表水平因素A乙醇浓度/%B大孔树脂用量/gC大孔树脂吸附时间/minD乙醇用量/mL1703.015602754.520703806.025803 结果与讨论3.1 菜豆粗皂苷提取工艺流程研究结果经典正丁醇提取方法和超声

42、波-乙醇提取方法结果比较见表3-1。表3-1 两种提取方法结果比较表组别泡沫试验溶血程度得率/mg·g-1经典正丁醇提取法大量泡沫，20min不褪0.417超声波乙醇提取法大量泡沫，20min不褪0.610由表3-1可见，超声波-乙醇提取法的溶血程度和得率都优于经典正丁醇提取法。此外经典正丁醇法操作流程繁琐，操作条件不易控制，而且正丁醇用量大，回收成本高，易造成环境污染，而超声波-乙醇提取法在上述方面都优于正丁醇法，故采用超声波-乙醇提取法。3.2 菜豆粗皂苷振荡纯化工艺流程研究结果大孔树脂振荡纯化前后比较结果振荡纯化工艺流程研究，以泡沫实验和溶血程度为纯化指标，振荡纯化前后效果比较

43、见表3-2。表3-2 振荡纯化前后效果比较表组别泡沫实验溶血程度提取后纯化后提取后纯化后粗提液大量泡沫，20min不褪大量泡沫，20min不褪人参皂苷对照大量泡沫，20min不褪大量泡沫，20min不褪自来水对照少量泡沫，5s内褪去少量泡沫，5s内褪去空白对照无泡沫无泡沫注：高度溶血（）；中度溶血（）；轻度溶血（）；不溶血（）从表3-2可知：通过对溶血程度的观察得出，人参皂苷对照和自来水对照组呈阳性且溶血程度高，空白对照组（即生理盐水）呈阴性，粗提取液溶血，结果理想。另泡沫实验表明，泡沫持续时间超过20min。大孔树脂振荡纯化结果大孔树脂振荡纯化结果以提取液和解吸液的颜色变化程度为评价指标，大

44、孔树脂振荡纯化脱色结果见表3-4。表3-3大孔树脂振荡纯化结果组别纯化效果提取后纯化后粗提液棕黄色浅黄色人参皂苷对照无色无色自来水对照无色无色空白对照浅黄色浅黄色大孔树脂振荡纯化与层析纯化比较结果振荡纯化效果和柱层析纯化效果的比较以解吸液的颜色为评价指标，纯化效果的比较见表3-4。表3-4纯化效果的比较组别纯化效果提取后纯化后振荡纯化棕黄色浅黄色*柱层析纯化棕黄色无色*柱层析纯化为其他同学毕业论文研究结果。结论由表3-4可知振荡纯化方法纯化后的解吸液颜色深于柱层析纯化方法，即振荡纯化方法的纯化效果不如柱层析纯化方法。虽然振荡纯化方法纯化后的产品颜色和纯度都不如柱层析纯化方法，但振荡纯化方法的操

45、作步骤简单、实验条件容易控制，纯化时间短。而柱层析纯化方法操作步骤繁琐，耗时长，对实验仪器和实验条件要求高。实际应用中可以根据后续研究的目的选择纯化方法，若要进行皂苷的结构分析和表征实验等对纯度要求较高的工作时，就要采用大孔树脂柱层析纯化方法。当进行毒性（急性、亚急性、慢性）实验时，便可以采用大孔树脂振荡纯化方法。3.3 振荡纯化单因素实验结果3.3.1 大孔树脂吸附时间对纯化效果的影响结果大孔树脂吸附时间对纯化效果的影响见图3-1。图3-1大孔树脂吸附时间对纯化效果的影响由图3-1可知，随着吸附时间的延长得率先增大后减小，得率在吸附时间为20min时达到最大。吸附时间超过20min，继续延长

46、吸附时间，得率反而下降。当大孔树脂吸附的皂苷量未达到最大时，即得率最大时，延长吸附时间，可以增加皂苷的吸附量，得率上升；但当吸附量达到最大时，由于皂苷也溶于水，继续延长吸附时间，一些被大孔树脂吸附的皂苷又被水解吸下来，使得率下降。3.3.2 大孔树脂用量对纯化效果的影响结果大孔树脂用量对纯化效果的影响结果见图3-2。由图3-2可以看出，大孔树脂用量越多，皂苷得率增大，当大孔树脂用量达到6g时，皂苷得率最大，此时皂苷得率为0.606 mg ·g1，但继续增加大孔树脂用量，皂苷得率反而下降。随着大孔树脂用量的增加，皂苷的吸附量也随之增加，即得率增高。当用乙醇解吸时，大孔树脂用量越多，皂苷

47、的损失量也越多，即得率下降。当前者的作用大于后者时，得率上升；若前者的作用小于后者时，得率下降。图3-2大孔树脂用量对纯化效果的影响3.3.3 乙醇洗脱浓度对纯化效果的影响结果乙醇洗脱浓度对纯化效果的影响结果见图3-3。图3-3 乙醇洗脱浓度对纯化效果的影响由图3-3可看出，随着乙醇浓度的增大，皂苷得率的趋势为：先上升，达到最高点后下降。在乙醇浓度为80%时，得率最高。高浓度的乙醇比低浓度的乙醇对皂苷得率的影响大。低浓度的乙醇洗脱皂苷的能力低，但浓度过高则会破坏皂苷。3.3.4 乙醇用量对纯化效果的影响结果乙醇用量对纯化效果的影响结果见图3-4。图3-4乙醇用量对纯化效果的影响由图3-4可看出

48、，随着乙醇用量的增大，皂苷得率的趋势为：先上升，达到最高点后趋于平稳。其中在乙醇用量为50mL和60mL时，皂苷溶血效果最好，但得率不是最高的；在乙醇用量为60mL、70mL、80mL时，得率最高。在40ml与50mL之间得率增加明显，50mL之后，保持平衡，乙醇用量对皂苷得率的影响不大。3.4 正交试验测定的结果3.4.1 振荡纯化最优条件的研究结果振荡纯化最优条件的研究结果见表3-5。从表3-5中各个因素的R值可看出，各因素影响的主次地位为ACDB，即乙醇浓度对振荡纯化效果影响最大，其次是大孔树脂吸附时间，再次是乙醇用量，大孔树脂用量对振荡纯化结果影响最小。理论计算结果A3B3C2D3，即

49、80%、6g、20min、80mL。根据9组正交试验的结果可直观看出，第四组实验A2B1C2D3的皂苷得率最高，为0.555 mg ·g-1。因此，需对理论计算优水平A3 B3 C2 D3做验证实验。采用T检验法对理论计算优水平和正交试验实际得出优水平进行显著性分析，结果见。表3-5L9 (34)正交试验结果表实验号因素A乙醇浓度/%B大孔树脂用量/gC大孔树脂吸附时间/minD乙醇用量/mL皂苷含量/mg·g-1/%11（70）1（3.0）1（15）1（60）0.386212（4.5）2（20）2（70）0.459313（6.0）3（25）3（80）0.39042（75）

50、1230.555522310.435623120.50973（80）1320.452832130.518933210.530K11.2341.3931.4131.351K21.4991.4121.5441.420K31.5001.4291.3961.462k1=K1/30.4110.4640.4710.450k2=K2/30.5000.4710.5150.473k3=K3/30.5000.4760.4650.487R值0.0890.0120.050.037优水平A3B3C2D3根据正交表中皂苷含量的平均值（k）绘制直观图，见图3-50.300.350.400.450.500.55A1A2A3B

51、1B2B3C1C2C3D1D2D3水平因素k 值图3-5 因素水平的直观分析图3-5可知：三个因素的最佳提取条件都在比较理想的水平。因此，所选择的各因素的水平合理。3.4.2 实验结果的显著性分析用理论计算的优水平为：乙醇浓度80%、大孔树脂用量6.0g、大孔树脂吸附时间20min、乙醇用量80ml。正交试验最优得率组的因素水平为：乙醇浓度75%、大孔树脂用量4.5g、大孔树脂吸附时间20min、乙醇用量80ml。显著性分析计算公式为：T计 = 式中： X1 正交试验最优得率；X2 用理论计算优水平下的验证实验得率；X 正交试验最优得率与用理论计算优水平下的验证实验得率的平均值；n X2的平行实验组数；S 标准偏差；正交试验最优得率；经计算T计为0.705，查表得T表为4.303（p=0.05），T计T表，p0.05，所以理论计算组优水平与实验得出优水平差异显著。验证实验结果皂苷得率为0.610 mg·g-1。综合各实验结果，最后确定菜豆中皂苷的最佳