生物药物分析

1、生物药物分析复习第一章 绪论药物分析的性质：应用化学，物理化学和生物化学的方法和技术对药物的质量进行全面控制的学科。药物分析的任务：药物研制过程中的“眼睛”；制定药物质量标准；生产过程中的质量控制；开展临床药学研究；常规药品的检验。*药品质量标准： 国家对药品质量及检验方法所做的技术规定。是药品生产，经营，使用以及检验和监督管理部门共同遵循的法律依据。*中国药典的内容：凡例，正文，附录，索引。药检工作基本程序：取样，鉴定，检查，含量测定，书写检查报告。酶法分析（终点法，酶循环放大分析法，速度法） 是利用酶作为工具对特定物质（底物、辅酶、抑制剂和激动剂等） 进行定量分析的方法。终点法(总变量法

2、) 测定原理：先借助酶反应（单个酶反应或几种酶构成的偶联酶反应）使被测物定量的进行转变，然后在转变完成后，测定底物，产物或辅酶物质的变化量，因此称为终点法。终点法的条件： 1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品；2 能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件；3.反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定；4.在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。使用终点法测定应注意的问题 ：酶的底物的专一性（最好是绝对专一性）；反应的平衡；反应液中的酶量；反应产物的抑制。终点法的种类（一）单酶反应定量法：1、底物减少量的测定：胞嘧啶（28

3、0nm ）、腺嘌呤（280nm ）和尿酸（293nm 或 297nm ）。2.产物增加量的测定：（1）各种氨基酸和草酸（2）黄嘌呤、次黄嘌呤以及 CoA* 3.辅酶变化量的测定（理解例子 学会如何进行实验设计和分析）条件：测定以 NAD或 NADP为辅酶的脱氢酶的底物的量。原理：NADH 和 NADPH 在 340nm 有特征最大吸收峰，而 NAD 和 NADP 在 340nm 却无这一吸收带，故可应用于NAD 或 NADP 为辅酶的脱氢酶反应，通过测定 340nm 吸光度的变化，就可以对作用相应脱氢酶底物的物质进行定量分析。（二）和指示酶反应偶联的定量法1. 以脱氢酶为指示剂（理解例子 学会

4、如何进行实验设计和分析）2. 以脱氢酶以外的酶作为指示剂酶循环放大分析法具有化学放大作用，理论上可无限放大其灵敏度。是利用酶循环设计的一种超微分分析法。步骤：转换反应，循环反应，指示反应转换反应 ： 以试样中的待测组分为底物，经特异反应生成与待测组分相当的定量循环底物。循环反应 ：生成的循环底物反复参加由两个酶反应组成的偶联反应，所得产物量为循环底物的若干倍。指示反应 ：采用酶法测定反应产物。由反应产物量及循环次数，计算出循环底物量，再推算出试样中待测组分的量。酶循环放大分析法应用范围1. 有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定(NAD 、NADP 、CoA)2. 能与以上反应偶联的酶反应的底

5、物或酶可测定（GATPHK ） 酶循环放大分析应该注意的问题:1. 在进行循环之前，必须完全除去转换反应中剩余的辅酶；2. 在循环反应中底物（不是辅酶）必须过量；3. 要用已知量的循环底物做循环反应和指示反应以求得循免疫分析利用抗原抗体反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的方法。抗原与抗体性质 及其相互作用免疫球蛋白分子由两条重链（H 链）和两条轻链（L 链）通过不同数目的二硫键结成Y 形。在抗体分子的N 端为“多变区”（V 区），是抗体分子与抗原决定簇的结合部位；抗体分子的 C 端为“稳定区”（C 区），是抗体抗原特异性部位。 抗原抗体结合具有 高度特异性 。抗原的特异性取决于抗

6、原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决于抗体 Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合，如 范德华引力、静电引力、氢键及疏水性作用等。免疫扩散技术10第 27 页共 16 页基本原理 ：可溶性的抗原和相应的抗体在溶液或凝胶中彼此接触，形成不溶性抗原-抗体复合物沉淀。双向免疫扩散基本原理 ：指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。双向免疫扩散的 应用 ：1.抗原、抗体相对含量测定；2.抗原、抗体相对分子量分析酶免疫分析技术基本

7、原理 ：指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它采 用抗原与抗体的特异反应与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。酶联免疫吸附试验（ ELISA） ：结合在固相载体上的抗原（抗体）与待检抗体（抗原）酶偶联物（标记物）反应后， 催化水解或氧化还原酶的相应底物呈色，其颜色深浅与待测抗原（抗体）含量成正比。包被 ：指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物理吸附作用，一般靠疏水键连接。封闭：指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残留的未饱和位吸附位点的过程。常规使用的 ELISA 技术主要有：直接 ELISA ：测抗原间接 ELISA ：测抗体夹心 ELISA ：测抗原竞争 ELISA

8、：测抗体或抗原及半抗原反向捕捉 ELISA ：测特异性 IgM单位点非竞争 ELISA ：主要测半抗原细胞 ELISA ：测细胞表面抗原夹心 ELISA基本原理 ：样品中抗原与载体上抗体结合，经洗涤加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，可定量测定抗原。双抗体夹心法测抗原 ：应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体包被和酶标抗体，以检测相应的抗原。此法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原。双抗原夹心法测抗体 ：用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法适用于多价大分子抗原（血清中 HBsAg 、A

9、FP 和尿液 hCG ）的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。竞争 ELISA竞争法测抗体 ：待测抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。竞争法测抗原 ：待测抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。放射免疫测定 RAI 基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag ）和非标记的待检抗原（Ag ）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（ *Ag-Ab）的或游离（ *Ag ）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线

10、即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。免疫放射分析（ IRMA）基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物，并用固相免疫吸附剂作为B 或 F 的分离手段除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。放射免疫与免疫放射原理的区别IRMA与 RIA 的工作原理的主要区别项目反应机制反应试剂分离方法待测抗原复合物放射性非特异性结合待检抗原性质ELISA 操作要点：RIA （放射免疫） 竞争性反应三种标记抗原抗原只需一个抗原决定簇与待测抗原呈负相关主要影响高剂量反应半抗原及大分子IRMA （免疫放射）非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100 倍）二种标记抗体一般需单抗作分离剂，抗原需两个

11、或两个以上决定簇与待测抗原呈正相关主要影响低剂量反应蛋白质、酶等生物大分子加样 ：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。温育 ：常采用的温度：43、37、室温和 4（冰箱温度）。洗涤 ：是 ELISA 最主要的关键技术，目的是分离游离的和结合的酶标记物。洗涤方式自动板机、手工操作（浸泡式和流水冲洗式）。显色 ：影响因素：反应温度和时间；OPD底物液应避光显色，硫酸终止；TMB显色终止液：叠氮钠、SDS 、各类酸性终止液。比色 ：以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔）。*生物检定 是利用生物体包括整体动物、离体组织/

12、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较 供试品 和相当的 标准品 或 对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活 性或杂质引起的毒性。生物检定的作用：生物检定法具有独到的优势，主要表现在： (1)直接关切生化药物的有效性和安全性；(2) 量效关系确切，可为临床用药剂量的规范化提供参考；(3) 是反映产品质量的重要指标，具有专属性。生物检定在药物分析中的应用 ：1、药物的效价测定；2、大分子结构的测定；3、微量生理活性物质的测定；4、药物的毒性

13、成分及有害杂质的限度检查；5、新药研究。电泳技术的基本原理电泳：带电粒子在电场中的定向移动。在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象， 称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。电泳法:指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量的方法。颗粒在溶液中迁移的 驱动力 ：颗粒的有效电荷和电位梯度。影响电泳速度的 因素 ：颗粒性质；电场强度；溶液性质；电渗；焦耳热；筛孔:聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：以孔径大小不同的聚丙烯酰胺

14、凝胶为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层、缓冲液离子成分、PH 、电位梯度均不连续），使样品在不连续的两层凝胶之间积聚浓缩成很窄的样品区带（厚度为 0.1毫米），然后再进行分离，从而提高了分辨率。PAGE不连续系统的原理与技术不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种物理效应 ：样品的浓缩效应 ; 分子筛效应 ; 电荷效应。样品的浓缩效应:凝胶孔径不连续性 缓冲液离子成份的不连续性 PH 的不连续性电位梯度的不连续性*三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高。一般电泳分离的电荷效应：带电多，MW小，迁移快不连续系统对样品的浓缩效应：迁移率，被压成薄层凝胶对样品分子的筛选效应影响蛋白质与 SDS 的结

15、合程度的因素：溶液中 SDS 单体的浓度；样品缓冲液的离子强度；二硫键是否完全被还原SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和技术十二烷基硫酸钠（SDS ）是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS 复合物。蛋白质带上相同密度的负电荷；SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变；凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与蛋白质分子量相关。蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它 的分子量大小，而与所带电荷和形状无关。影响迁移率的因素：二硫键是否完全被还原；溶液中 SDS 的浓度；溶液的离子强度等电聚焦电泳(IEFE)是一种利用具有

16、 pH 梯度 的支持介质分离 等点电不同 的蛋白质的电泳技术。等电聚焦 就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中。*理想的载体两性电解质应具备的特征：分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；化学性质稳定；各成分的 pI 彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力；在 pI 处具有足够的电导，导电性均匀；两性电解质载体的数目要足够多；可溶性好；对 280nm 的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。高效毛细管电泳 HPCE ：是

17、以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品各组分之间迁移率和分配行为的差异，而实现分离的一种新型电泳技术。双向电泳 ：将样品进行电泳后，为了不同的目的在它的垂直方向再进行一次电泳的方法。双向电泳的种类：第一向等电聚焦，第二向 SDS 电泳第一向 SDS 电泳，第二向等电聚焦。常用的双向电泳为第一向等电聚焦，第二向 SDS 电泳。1. 抗原与抗体通过很弱的短矩引力而结合，如_范德华引力_、_静电引力 、_氢键_及 疏水性作用 等。2. 免疫分析法利用_ 抗原抗体 反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的方法。3. RIA 是以放射性核素标记抗原，使标本中 非标记抗原与试剂中

18、标记抗原竞争结合抗体，通过测定结合相的放射性强度，推定标本含量。4. 免疫印迹技术指的是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定 。5. *标准品 是指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。6. 聚丙烯酰胺凝胶制备时，聚合反应所使用的化学催化剂是 过硫酸铵TEMED 光聚合催化剂是 核黄素 。7. 带电粒子在电场中的移动速度主要决定于 颗粒性质电场强度 和 溶液性质。8. 蛋白质分子在 pH 高于其等电点的缓冲溶液中带 负 电，在电场中向 正 极移动。色谱分析按操作形式分类:纸色谱,薄层色谱,柱色

19、谱.纸色谱 ：以纸为载体,纸上所含水分或其他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色谱.纸色谱的影响因素 ：1 滤纸的影响 2 展开剂的影响 3 物质极性的影响 4 pH 的影响 5 温度和时间的影响薄层色谱选择吸附剂的原则（1） 样品组分的性质（2） 吸附剂的性质根据薄层色谱的分离机制，选择适宜活性的吸附剂。吸附剂对样品的作用：薄层的显色方法不同，所用的吸附剂也不同。吸附剂的规格对展开剂的要求(1) 能够溶解待测组分；(2) 能使待测组分与杂质分开；(3) 使待测组分的 Rf 值在 0.2-0.8之间；(4) 不能与待测组分或吸附剂发生化学反应 ； (5)具有适中的沸点和比较小的粘度；(6)展

20、开后组分的斑点圆且集中； (7)混合溶剂最好临用前新鲜配制薄层色谱法常见的问题和消除的方法：(一)斑点拖尾现象(二)边缘效应(三)S 形及波浪形斑点(四)斑点呈念珠状(五)展速慢(六) Rf值不稳定N = 16 (tr / w)2 = 5.54 (tr / w1/2)2 HETP=A+B/v+Cv分子筛的优缺点？1. 凝胶层析操作简便，所需设备简单。2. 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近 100。3. 分离条件缓和。4. 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽。5. 分辨率不高，分离操作较慢

21、。对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象 。检测器的类型 ： 紫外检测器；荧光检测器；示差折光检测器；蒸发光散射检测器；质谱检测器；电导检测器；PH 检测器。蒸发散射质量检测器的优缺点：1 与示差折光检测器相比：灵敏度高; 对流动相系统温度变化不敏感 ; 可进行梯度洗脱.2 与光吸收检测器相比：能解决最困难的 HPLC 检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测 ; 减低流动相溶剂的纯度要求; 无需测定定量校正因子.亲和色谱也称为 亲和层析，是一种利用固定相 的结合特性来分离分子

22、的色谱方 法。原理：将一对能可逆结合和解离生物分子 的一方最为配基（也称 为配体），与具有大 孔径、亲水性的固相载体相偶联 、制成专一的亲和吸附剂 ，再用此亲和吸附剂填充 色谱柱，当含有被分 离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时 ，亲和吸附剂上的配基就有 选择地吸附能与其结合的物质 ，而其他的蛋白质及 杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使 用适当的缓冲液使被分离物质与 配基解吸附，即可获得纯化的 目的产物。高效液相色谱基本仪器装置： 输液系统，进样系 统，分离系统，检测系统，数 据处理系统。容量因子：是指 在分配“平衡”后，组分在固 定相中的质量与在流动相中质量 的比值。也称为质量分配系数。拖尾因

23、子：T=W0.05h/2A 。0.95-1.05之间为对称峰，小于 0.95为前延峰，大于 1.05为拖尾峰。质谱分析法(mass spectrometry)将: 分和结构分析的一种分析方法。化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(/值)的不同进行分离测定，来进行成蛋白质质谱:是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(/值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定已知或未知蛋白质。质谱仪至少由以下四部分组成：进样系统按电离方式的需要，将样品送入离子源的适当部位；离子源用来使样品分子电离生成离子，并使生成的离

24、子会聚成有一定能量和几何形状的离子束；质量分析器利用电磁场（包括磁场、磁场和电场的组合、高频电场和高频脉冲电场等）的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置，时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离；检测器用来接受、检测和记录被分离后的离子信号。离子源的功能 是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此， 对于不同的分子应选择不同的离解方法。硬电离方法能给样品较大能量的电离方法软电离方法给样品较小能量的电离方法，该方法适用于不稳定或易电离的样品。电喷雾离子化技术（electrospray ionizati，onESI）利用强静电场从溶液直

25、接产生气态离子化分子的电离方式。ESI 可以与液相色谱、高效液相色谱、毛细管 IEF 以及毛细管电泳等多种进样器联用。ESI-MS 特点优点：解决了极性大、热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量、一级结构和共价修饰位点的测定问题， 并可用于研究 DNA 与药物、金属离子、蛋白质和抗原与抗体的相互作用。缺点：样品中的盐类对样品结果影响很大，而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰（重叠峰），所以对混合物的图谱解析比较困难。基质辅助激光解析电离(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学

26、基质(matrix混) 合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersourc。e)激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。MALDI-MS特点对于一些分子量较大(1000000Da)或疏水性强的蛋白质，MALDI比 ESI 更有效。MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物。只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用 MALDI进行分析。MALDI不受样品所含的添加物、缓冲液或盐的影响，且

27、灵敏度也比别的离子化方式高。核磁共振光谱学.具有非零自旋量子数的原子核具有自旋角动量,因而也就具有磁矩, 例如象 1H, 31P, 13C, 15N 等原子核.磁矩是一矢量. 如果含有此类核的物质置放于磁场中 ,原来无规则的磁矩矢量会重新排列而平行于外加的磁场 .与外磁场同向和反向的磁矢量符合 Boltzmann分布.在数量上同向与反向的差别很小,但正是这一微小的差别造就了核磁共振光谱学.x-射线衍射技术和 NMR技术在研究蛋白质空间结构中的优缺点? x-射线衍射技术固体状态，可以测定中-大蛋白质结构，技术更成熟；需结晶，经常存在相位问题。NMR技术溶液状态，接近生理状态，不需结晶，可研究蛋白

28、质动力学过程，可以较方便地研究蛋白质-配体相互作用；只能测定小-中蛋白质结构，技术还在发展。蛋白质类药物分析来源：天然来源(提取)；化学合成或者半合成；现代生物技术制备。近年来 SFDA批准的生物技术药物：干扰素（1b，2b，2a，）；白细胞介素-11；重组人胰岛素、重组甘精胰岛素注射液、重组赖脯胰岛素注射液；白细胞介素 -2；G-集落刺激因子、GM- 集落刺激因子；肿瘤坏死因子-；红细胞生成素；链激酶、葡激酶；人、牛碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子。氨基酸重要化学反应：*a. 与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定.b. 与 2,4一二硝基氟苯(DNFB) 的反应（sanger反应）

29、:用于蛋白质 N-端测定.c. 与苯异硫氰酯（PITC ）的反应（ Edman反应）：用于蛋白 N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。蛋白质的理化性质：两性解离性质及等电点： 蛋白质胶体性质； 蛋白质的沉淀；蛋白质的变性与复性；蛋白质的紫外吸收特性； 蛋白质呈色反应。氨基酸组成分析的步骤：水解，衍生（柱前衍生化和柱后衍生化），色谱流程：样品阳离子交换柱衍生化（茚三酮）检测柱后衍生化：将水解后的氨基酸样品经过离子交换柱分离。原理：1.氨基酸具有不同的酸碱性，极性，可用阳离子交换树脂在色谱柱上进行吸附，用不同PH 和离子强度的缓冲液依次将它们洗脱；2.酸性氨基酸对阳离子交换树脂的亲和力最弱，

30、先洗脱下来； 3. 中性氨基酸对阳离子交换树脂的亲 和力次弱，跟着洗脱下来；4. 碱性氨基酸对阳离子交换树脂的亲和力最强，最后被洗脱下来；5.洗脱后用茚三酮显色， 进行定量测定。蛋白质常用的水解方法：酸性水解（盐酸水解和磺酸水解）；碱性水解；酶水解；微波辐射能水解；膜上蛋白质印迹样品的水解（原位分析）。盐酸水解得到除色氨酸和胱氨酸外的氨基酸；碱性水解得稳定色氨酸。几种常见的氨基酸分析方法： 1、茚三酮反应2、荧光胺法3、邻苯二甲醛(OPA)法4、PTC-AA分析法5、Dansyl-Cl（DNS-Cl ）法6、磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法蛋白质的 N-末端的测定1、二硝基氟苯法（D

31、NFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl 法）3、异硫氰酸苯酯法（PITC 法）4、DABITC法5、氨肽酶法蛋白质的 C 末端的测定1、羧肽酶法2、硼.氢化锂法（LiBH4 法，还原法）3、肼解法蛋白质二级结构测定:采用 圆二色光谱 测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。蛋白质三级结构测定X 射线衍射法和核磁共振技术 是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。蛋白质纯度检查： 非还原SDS-PAGE电泳法 和 HPLC 法 (分子筛层析、反相 HPLC 、离子交换层析等)蛋白质含量测定Folin酚- 试剂法(Lowry 法)、染色法(Bradford法)、双缩脲法、紫外吸收法

32、、HPLC法和凯氏定氮 ELISA 法考马斯量蓝 G250BCA 法（4-甲酸喹啉法）等方法。凯氏定氮法原理：当蛋白质与浓硫酸共热时，被氧化为二氧化碳和水，而氮转化为氨，氨与硫酸结合成硫酸铵，称 为“消化”。硫酸铜用作催化剂。消化液转入凯氏定氮仪反应室中，加入过量浓氢氧化钠，使硫酸铵分解放出氨，将氨驱入过量的标准硼酸溶液中，用标准盐酸进行滴定。双缩脲法原理：蛋白质含有两个以上的肽键。在碱性溶液中与Cu2+ 形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。540nm 比色。福林酚法原理：蛋白质用碱性铜溶液（酚试剂）处理，使其形成铜蛋白质络合物。该络合物中的酪氨酸，色氨酸能还原磷钼酸-磷钨酸试

33、剂（Folin试剂），产生深蓝色。660nm 比色。蛋白质相对分子质量测定 ：还原型 SDS-PAGE 法测定；凝胶过滤(分子筛)法：根据蛋白分子大小和形状进行测定，误差比 SDS-PAGE 大；质谱法；梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳。梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 ：在梯度凝胶电泳中，蛋白质在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减小的方向迁移，随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越来越大。在梯度凝胶电泳中，蛋白质的最终迁移位置 仅取决于它本身分子的大小，与蛋白质电荷密度无关。蛋白质的相对迁移率与其分子量的对数在一定范围内呈线性关 系。肽图常用的分析方法有：（1）SDS-PAGE 电泳（2）反相

34、 HPLC(RP-HPLC) （3）毛细管电泳（4）液质分析。糖蛋白的糖基化分析 : 糖基化位点,分子量,糖的组成,连接方式,分析方法: 酶解,质谱,LC/MS,GC/MS宿主细胞蛋白含量：双抗体夹心 ELISA概念：宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程药物中的宿主蛋白含量，可用 ELISA 法测定。测定方法 包被；加样；加抗体；检测。*宿主细胞 DNA 残留量测定方法概念：供试品中的DNA 经变性为单链后吸附与固相膜上，在一定温度下。可与相匹配的单链 DNA 复性而重新结合成双链 DNA ，称为“杂交”。将特异性 DNA 探针标记后，与吸附在

35、固相膜上的供试品单链 DNA 杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性 DNA 对照对比后，可测定供试品中外源性 DNA 的含量。*宿主细胞 DNA残留量测定方法： 标记 ；杂交；免疫检测蛋白质最终产品的控制*1物理化学鉴定（1）氨基酸组成（2）氨基酸末端序列 N-端和C-端氨基酸（3）肽谱（4）巯基和二硫键巯基和/或二硫键的数量和位置（5）碳水化合物结构中性糖、氨基糖、唾液酸（6）分子量应用分子筛层析法、SDS-PAGE（还原和/或非还原条件下）、质谱测定法（7）等电点 通过等电聚焦电泳或其他适当的方法测定。（8）消光系数（或克分子吸光度）（9）电泳图型（10）液相层

36、析图谱 分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析获得目的产品/药物的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据 （11）光谱分析2. 杂质检查（1）工艺相关杂质（2）产品相关杂质3. 生物学测定（1）鉴别试验应用免疫印迹法（2）效价测定（3）特异比活性测定（4）热原质试验（5）无菌试验（6）抗原性物质检查（7）异常毒性试验氨基酸定量法：茚三酮法，三硝基苯磺酸法，铜复合物紫外吸收法，甲醛滴定法，非水溶液滴定法，双波长分光光度法，导数分光光度法，HPLC 。*茚三酮法：茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，还原型茚三酮。还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合

37、生成蓝紫色的物质。最大吸收值波长 570nm.*甲醛滴定法：在 PH 中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结合，使平衡向右移动，促使氢离子释放，使溶液酸度增加。每释放出一个氢离子，相当有一个氨基酸。(成品测定)非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。适合成品测定)，有直接滴定法和回滴法。合成多肽药物类药物分析化学合成多肽分类:纯天然多肽；经结构修饰的天然多肽；人工设计出的多肽。制备方法：液相合成和固相合成液相合成的优点:中间产物纯化、中间产物的理化常数、可以随意进行非氨基酸修饰、可以避免氨基酸缺失。缺点：是较为费时、费力等。固相合成优点：是简化了每步反应的后处理操作，避免因

38、手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等。缺点：是每步中间产物不可以纯化，必须采用较大的氨基酸过量投料，粗品纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段进行纯化等。液相合成法较适于合成 短肽；固相合成法更适于合成 中、长肽 。多肽药物不稳定的原因:水解、氧化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、消除、凝聚、沉淀、吸附等。结构确证研究1. 短肽 ：元素分析、红外光谱、核磁共振谱、氨基酸组成分析、质谱等常见方法，氨基酸序列测定。2. 中、长肽 ：氨基酸组成，氨基酸序列分析。（Edman 降解，质谱：分子量及其序列信息，是对 Edman 降解的很好补充。）原料药的质量研究项目一般包括：外观

39、性状、理化常数、鉴别、氨基酸组成分析、水分、反离子含量、纯度、有机溶剂和反应试剂残留量、生物学安全性检查、含量和/或活性效价测定等。相关肽检查（或称有关物质检查）：RP-HPLC ，（HPIEC ）、毛细管电泳技术，高效分子排阻色谱（ HPSEC ）、（PAGE ）以及激光散射粒度测定等技术。酶类药物分析酶的分类：氧化还原酶;转移酶；水解酶；裂合酶；异构酶；合成酶（或称连接酶）酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化 1mol 底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位。酶的比活力每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg 。*酶活性测定影响因素 ：底物；pH ；温度；酶浓度 ；空白和对照。以 Km 最小

40、者作为此酶的生理底物底物与产物的测定方法 （酶反应的检测方法）1、化学方法：用化学法测定其中某一底物或产物的变化值。2、分光光度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。3、荧光测定法： 简单、灵敏、快速。4、电化学分析法（1）离子选择性电极分析法（2）微电流法5、其他方法：如测定气体的测压法，测定产物旋光度变化值的旋光测定法。酶活力测定方法（固定时间法，连续监测法，固定浓度法）1. 固定时间法在适宜的条件下，使酶和底物共同保温 一定时间 ，然后测定 产物生成的量或底物消耗的量 ，从而计算出酶的含量（或活力）。2.连续监测法在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量或产物生成量。（一）、需 NA

41、D+ 或 NADP+作指示的连续监测法：直接测定法 ；偶联法 ； 三联酶活测定还原型辅酶（NADH和 NADPH）在 340nm 处有紫外吸收，氧化型辅酶（NAD+ 和 NADP+ ）在 340nm 处无紫外吸收.利用 340nm 处每分钟吸收度升高或降低的速率与酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。A. 直接测定法大多数需 NADH （NADPH ）参加的脱氢酶，可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在 340nm 处吸收度的变化， 计算酶活力单位。B. 偶联法此类酶催化反应不需 NAD+ 或 NADP+ ，但当与需 NAD+ 或 NADP+ 的脱氢酶反应偶联以后，能用紫外分光光度法测定.C

42、. 三联酶活测定引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联系起来，组成一个“三合一”酶反应系统，使底物转化率、辅助酶反应和 NADH （NADPH ）氧化速率之间成正比函数关系，辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。（二）、不需 NAD+ 或 NADP+作指示的连续监测法：酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身无色，经 酶作用后释放出有色的反应产物 。根据反应过程中吸收度增高速率，算出酶活力单位。3.固定浓度法根据酶催化反应，使 反应产物 达到额定的浓度时其反应时间与酶浓度成反比的原理进行设计的。正交设计多因素选择正交试验设计（Orthogonal experimental

43、design）是一种高效的利用正交表来安排多因素多水平设计试验的方法。通过巧妙的安排和分组，用较少的试验次数，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的试验条件。利用各因素所对应指标的极差 R 及平均极差 D 作出判断。*酶类药物的检测 （底物，原理，靶点）1. 肽键水解酶 ：1、胰蛋白酶 2、弹性蛋白酶 3、尿激酶（气泡上升法）*胰蛋白酶原理胰蛋白酶专一作用于 赖氨酸、精氨酸 等碱性氨基酸的羧基组成的肽键、酰胺键及酯键，水解速度为酯键>酰胺键> 肽键。底物：BAEE；BAA苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE ）在胰蛋白酶的作用下， 酯键 被水解生成苯甲酰L精氨酸，在 253nm 波长处的吸收

44、度随酶促反应递增，因此连续记录不同时间的产物生产量，根据活力单位定义计算酶活力。*胰弹性蛋白酶（肽键水解酶） 底物：刚果红弹性蛋白胰弹性蛋白酶测定原理刚果红弹性蛋白法：以刚果红弹性蛋白为底物，由于刚果红弹性蛋白结合的共价键能被弹性酶水解，根据刚果红在 495nm 处有最大吸收，由标准曲线即可查得弹性酶单位数。单位：20 分钟水解 1mg 刚果红弹性蛋白所需的酶量为一个弹性酶活力单位。尿激酶（碱性蛋白水解酶）作用于纤维蛋白溶解酶原的赖氨酸或精氨酸键使其裂解成纤维蛋白溶解酶。效价测定原理(气泡上升法)尿激酶激活人体内纤维蛋白溶酶原使其转化成纤维蛋白溶酶；纤维蛋白原在凝血酶的作用下，转变成纤维蛋白凝

45、块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用下，水解为可溶性小分子多肽。在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，尿激酶量与纤维蛋白凝块的溶解时间的对数成直线关系。反应系统应在 3045 秒内凝结，当凝块内小气泡上升到系统体积一半时作为反应终点。以尿激酶的浓度为横坐标，以反应时间的对数为纵坐标。底物：纤维蛋白溶酶原2. 脂键水解酶胰脂肪酶底物: 橄榄油3. 糖苷键水解酶 溶菌酶（能分解粘多糖的碱性水解酶）效价测定 比浊法底物: 溶酶小球菌以 溶酶小球菌 为底物，主要成分为粘多糖，粘多糖由 NAG和 NAM重复而成。只能水解 NAM C1和 NAG C4之间的1，4 糖苷键。4. 超氧化物歧化酶 SOD测定方法：间接法：使

46、用氧自由基指示清除剂， SOD与指示清除剂竞争 O2- ，从而抑制指示清除剂与 O2- 的结合，根据指示清除剂与 O2- 反应速度的变化可间接测定 SOD 的活性。间接法包括：黄嘌呤氧化酶细胞色素 C 法和邻苯三酚法。*黄嘌呤氧化酶细胞色素 C 法原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤成尿酸，与此同时产生O2- ，氧化型细胞色素C 被 O2- 还原为还原型细胞色素 C ，后者在 550nm 有最大吸收，因此测定氧化性细胞色素 C 在加入 SOD 前后的光吸收变化可间接计算酶活性。邻苯三酚法原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化生成红 棓酚，同时生成 O2- ，当有 SOD存在时由于它能

47、催化O2- 与 H+ 结合生成 O2 和 H2O2 ，从而阻止了中间产物的积累。定义:在一定条件下， 每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50的酶量 为一个酶活力单位。多糖类药物分析多糖的理化性质: 旋光性 ; 硫酸蒽酮反应（620nm ）硫酸苯酚反应(490nm) ;氨基己糖乙酰丙酮(525nm) 糖; 醛酸硫酸咔唑(520nm) .多糖的纯度测定：超离心法，电泳法，凝胶色谱法，旋光法。多糖的分子量测定1. 凝胶层析法 ：将分子量不同的蛋白质通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离。最先淋出的是最大的分子。Sephadex G-200，多糖标准品。分部收集，

48、硫酸-苯酚检测，分别求得洗脱体积 Ve， Ve 与 1gM 之间存在着线性关系， 绘制标准曲线。Ve=-KlogM+C将待测样品上柱，待测多糖 Ve。通过标准曲线求出待测多糖分子量。2. 粘度法3. 超离心法4. 高效液相色谱（重均分子量）色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。标准曲线：LogMW = a+b tRMW为重均分子量，tR 为保留时间待测多糖分子量 （重均分子量）Mw= (RIiMi)/RIiMi 为供试品在保留时间 ti时的分子量，RIi在第 i部分中被洗脱物质的量（重量）。多糖的含量测定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠）生色

49、底物法（低分子量肝素钠） 1.乙酰丙酮法氨基己糖原理：氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈红色，于 525nm 测定吸收度。2.硫酸咔唑法测糖含量（己糖醛酸测定）在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。520nm 比色3.硫酸苯酚法测定糖含量（总糖）原理：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反应生成橙色衍生物。它在 490nm 处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。4.蒽酮法测定糖含量（总糖）原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生产糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm 进行比色测定

50、。*生色底物法原理肝素、低分子肝素当蛋白酶（Fa）从生色底物分裂出 pNA 时，发色物的产生量 与剩余的酶量成正比，与 肝素效价成反比 。405 nm 测定。（pNA 对硝基苯胺）酰胺分解法当蛋白酶从生色底物分裂出 pNA 时，发色物的产生量与剩余的酶量成正比，与 肝素效价 成 反比 。405 nm测定。*生色底物法(抗 Xa 因子活性测定 )以溶液吸收度和浓度的对数，照生物检定统计法中 量反应平行线 测定法计算出供试品的抗 Xa 因子活性. 生色底物：Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰， Tos：甲苯磺酰；对-硝基苯胺（pNA ）。多糖类药物的结构分析1. 糖苷键连接方式的测定 A.红外光谱糖苷键

51、类型确定吡喃糖糖苷键时，用红外光谱，在 890cm-1 处有特征吸收者，示有-型糖苷键在 840cm-1 处有特征吸收者，示有-型糖苷键。B.核磁共振谱糖苷键（型或型）。2. 糖苷键连接位置的测定*（一）、高碘酸氧化、Smith 降解原理：选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子中 1，2二羟基和 1，2，3三羟基，生成 过碘酸氧化产物 ； 此产物用 硼氢化钠 还原后，再用酸水解，生成相应的醛、甲酸。室温下用 稀无机酸 水解还原产物。A. 1，2 连接的糖苷键1，2 连接的糖苷键经 高碘酸氧化 后的产物用 硼氢化钠还原 得到稳定的多羟基化合物，再用 稀盐酸 水解，得到甘油及甘油醛。B. 1，3

52、 连接的糖苷键1，3 连接的糖苷键与高碘酸不起反应，经还原与水解后得到原来的 单糖 。C. 1，4 连接的糖苷键1，4 连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤藓醇和乙醇醛。D. 1，6 连接的糖苷键1，6 连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及乙醇醛。（二）、甲基化反应产物分析原理：多糖经甲基化试剂作用使分子中的羟基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以 气相色谱 鉴定甲基化水解产物。如多糖分子中带有支链，甲基化水解后可生成 二甲基单糖 。（三）、乙酰解后质谱分析原理：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸

53、）生成乙酰化单糖和寡糖。用氯仿抽提，蒸去氯仿，进行质谱分析。分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖碎片峰，表明有支链结构。抗生素类药物分析*微生物检定法定义：是利用微生物发育时对某些物质的特殊依赖性，按这些物质对微生物生长的影响，对他们作出定量鉴定的方法。*微生物检定法可分为三类：稀释法；比浊法 ；琼脂扩散法（管碟法）。*牛津单位:抑制 50 毫升肉汤培养基中金黄色葡萄球菌生长的青霉素的最低含量为一个牛津单位.一个牛津单位相当于 0.6ug的青霉素钠盐所具有的抗生活力，1mg 青霉素G 钠盐含有 1667 个牛津单位,(IU)（一）稀释单位 (u/ml，u/mg)将 1mg 抗生素配成溶液，在

54、一定条件下进行稀释，对某一细菌能抑制其生长的最高稀释度，即为1mg 抗生素中可含有的单位。（二）重量单位 (u/mg)以抗生物有效成分（即生理活性部分）的重量作为抗生素的单位。称重量单位.1 类似重量单位: 以抗生素盐类纯品的重量为单位。包括无生物活性的酸根和金属离子。2 重量折算单位：以与原始的生物活性相当的纯抗生素实际重量为一个单位，3 特定单位 ：以特定抗生素某一批产品的某一重量为一个单位，经有关国家权威机构认可而定.效价测定的方法：稀释法；比浊法；琼脂扩散法。稀释法原理 ：用液体培养基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定

55、的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。比浊法原理 ：将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养（约 3-4h），测量培养基浊度，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定的范围内符合比耳定律。细菌数、细菌群体质量又直 接受抗生素效价的影响。影响因素：一、影响比浊法的物理因素：1、散射现象 2、菌液浓度 3、细菌体大小的变化二、培养基：在没有外加抑制剂的情况下，菌体的生长受培养基的成分、酸度、培养温度、通气等条件影响。三、培养：温度、振摇。一般培养时间 3 小时，可缩短为 2 小时。*管碟法原理: 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素

56、的 球型区 ，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈， 抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比 。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时 ，标准品溶液和供试品溶液对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为一剂量法、 二剂量法 及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价。log M(1 /9 .21 DT )r 2log C4 DTH)T = 扩散时间M = 抗生素在管中的量L = 管的高度H = 培养基的厚度D = 扩散系数r = 抑菌圈半径c = 最低抑菌浓度影响抑菌圈半径的因素： D 的影响因素 ：抗生素本身结构、分子量等，结构简单者容易扩散，分子量大的扩散就慢，杂质 ：抗生素或培养基中含有杂质，杂质本身也有扩散系统，看干扰抗生素的扩散，影响抑菌圈的大小和清晰度。琼脂含量