离子通道神经递质耳蜗机制

1、.离子通道，神经递质，耳蜗机制来源：上海交通大学医学院附属新华医院耳鼻咽喉-头颈外科听觉器官，即耳蜗，被认为是人体当中最复杂的机械感受器。高度分化作为感觉上皮组成的内外毛细胞具有非常独特的细胞结构，细胞外的离子环境亦不对称。在顶端表面突起静纤毛，面对高K+低Na+和极低Ca2+(10-5mol/L)的内淋巴液，底侧膜被支持细胞包绕分别与传入和传出神经建立突触联系，则浸浴在高Na+低K+和低Ca2+(10-3mol/L)的外淋巴液中。最近二十年以来，随着电生理听生理分子生物学等研究手段的日益先进，毛细胞和整个耳蜗的活动机制在分子和细胞水平上逐渐被揭示，对毛细胞机-电转换的分子机制，即静纤毛的换能

2、通道产生感受器电位、侧膜离子通道的调节作用和突触释放递质三个相互关联的过程，以及毛细胞频率调谐(frequency tuning)功能-电共振(electrical resonation)现象有了较为深入的了解。一、耳蜗毛细胞的离子通道耳蜗毛细胞与其它细胞一样，其活性要依赖于细胞膜对胞外离子的选择通透性，这种功能的实现是通过通道完成的。毛细胞不对称的离子环境需要在细胞膜上有不对称的离子通道存在，因此各类通道不均匀地分布于毛细胞表面。1.毛细胞顶端离子通道：机械-电转导(mechano-electrical transduction,m-e.t.)通道与受体电位m-e.t.通道位于毛细胞的静纤毛

3、上，确切的位置是在连接相邻静纤毛的顶端连接处还是在靠近基底的静纤毛踝区，目前尚有争论。每个细胞的转化通道的数量约为280个,如果转化通道是均匀分布于静纤毛上，每一根静纤毛上约有4个转换通道。每个机电转换通道由一个膜内在蛋白构成，缺乏离子选择性，碱金属和碱土金属阳离子如Na+、K+、Rb+和Cs+，二价阳离子如Ca2+、Mg2+，小的有机离子如胆碱离子、四乙胺(TEA)均能通过，但稍大些的离子就不能通过，这表明通道直径约为0.7nm。m-e.t.通道对阳离子的通透顺序是Li>NaKRb>Cs>Choline>TMA>TEA，相对于Cs+的离子渗透性,双价离子中Ca2

4、+最大，一定量的极少的Ca2+在转导过程中是必须的，对转导通道的影响是全或无式的。单个m-e.t.通道的电导约为100pS。静纤毛之间有两种连接，即顶端连接和侧连接，前者位于静纤毛顶部与相邻较高静纤毛的侧壁之间，后者位于前者之下，使邻近各静纤毛在各个方向连接而使静纤毛集中，作为一个整体接受机械刺激，传导一致的向量。据此提出的m-e.t.通道的门控过程的模型认为，顶端连接是一种门控弹簧，通过顶端连接的中央细丝直接控制通道，当毛细胞静纤毛向最高静纤毛一侧偏斜时，膜电导增强，即细胞膜对阳离子通透性增加，细胞去极化；向相反方向偏斜时，可使细胞超极化。用机械刺激使毛细胞的静纤毛发生偏离可诱发m-e.t电

5、流。最小的能产生m-e.t电流的位移是100埃，相当于静毛束的角位移。m-e.t通道的门控动力学依赖于毛束的角位移，而不是毛束的绝对位移10。内淋巴液中富于K+，而缺乏Na+和Ca2+，因此推测m-e.t电流的主要携带者为K+。m-e.t电流可被链霉素或新霉素阻断，可能抗生素分子插入了机械门控通道，以一种电压依赖的方式阻断了它。非选择性的阳离子(主要是K+)内流使毛细胞去极化，从而形成了受体电位。对牛蛙球囊毛细胞毛束的刺激，可使其膜电位去极化至20mV。机械刺激引起的静纤毛偏斜通过调节m-e.t.通道的开放和关闭时程来控制通过的离子电流的大小，也间接影响受体电位的形成。2.毛细胞底侧膜离子通道

6、：迄今在毛细胞底侧膜上已发现的电压依赖性通道有钾离子通道和钙离子通道。前者包括钙离子激活的钾通道(携带IK(Ca)外向延迟整流钾通道(携带IK) KA通道(携带IA)和Kn通道(携带IK,n)。后者是L型钙通道。2.1钙离子激活的钾通道：毛细胞的钙离子激活的钾通道分为大电导(BK)型和小电导(SK)型，两者见于所有被研究过的毛细胞。BK和SK通道均有赖于Ca2+的激活，生理条件下激活BK通道所需的胞内Ca2+浓度(Ca2+i)为35M，在海龟毛细胞SK通道对Ca2+的敏感性5倍于SK通道。豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)的BK单通道电导为220pS。BK通道的激活电压大于-60mV-45mV，平均开

7、放时间0.0812ms，通道电导越大细胞静纤毛束越长则平均开放时间越长。Charybdotoxin是其相对特异性的阻断剂，常作为区分BK通道的工具药。BK通道在靠近蜗底的较矮毛细胞上优势表达。SK通道的特点：单通道电导低(440pS)，几乎无电压敏感性，nM级的Ca2+i就可激活通道，Apamin是其特异性的阻断剂。在一些组织中，SK通道能被毒蕈碱(乙酰胆碱受体激动剂)激活，通过三磷酸肌醇(IP3)使细胞内钙释放。2.2外向延迟整流钾通道是一种电压依赖性的钾通道，膜去极化时激活，不依赖于Ca2+i，其特点符合外向延迟整流钾通道的标准。其单通道电导为8pS，激活电压大于-60mV，激活时间常数为

8、2100ms，激活和失活缓慢，对4-氨基吡啶相对较敏感，不被Apamin和Ba2+阻断。在靠近蜗顶的较高毛细胞上优势表达。2.3 KA通道KA通道的特点是在去极化时快速激活，然后以指数时间过程很快衰减，能被4-氨基吡啶阻断。在豚鼠OHC中，KA通道的电导较小，其携带的IA难以从总电流中区分。KA通道的激活电压小于-44mV，激活时间37ms，失活电压大于-56mV，失活时间73ms。在电调谐的电压范围内，IA是失活的，对膜电导没有贡献。KA通道无Ca2+依赖性。IA在鸟类基底乳头中的矮毛细胞上优势表达。2.4 Kn通道在豚鼠OHC底侧膜表面的Kn通道首先由Housley和Ashmore报道。其

9、在静息电位时就已激活，膜电位超极化时失活，完全激活电压为-40mV，半量激活电压为-91mV，完全失活电压为-160mV。通道的活性依赖于Ca2+i，但不受电压依赖性钙通道的影响。能被Cs+和Ba2+阻断。越靠近蜗底的OHC越优势表达Kn通道。2.5钙通道在其它组织中发现的电压依赖性钙通道分为六型(L T N P Q R型)22。存在于豚鼠OHC鸡耳蜗毛细胞底侧膜表面的钙通道均为L型。毛细胞的离子电流中钾电导占优势，只有将钾电流完全阻断，才可获得内向的钙电流。OHC的钙通道在-30mV时激活，20mV时达到峰值。其离子选择性为Ba2+Ca2+Sr2+。能被Cd2+和nifedipine阻断，B

10、ayK8644增加Ica的幅度。鸡基底乳头中的高矮毛细胞的Ica在电压激活范围药理学通道动力学等方面没有差别，与钾电流相反。3.毛细胞m-e.t.通道和底侧膜电压依赖性通道的功能Hudspeth提出毛细胞内电谐振的模型：当静纤毛受到刺激向最长静纤毛方向偏斜时，K+通过静纤毛上的m-e.t.通道流入细胞，使细胞去极化，继之又使电压依赖性Ca2+通道激活，Ca2+内流；当胞内Ca2+i增加至一定水平，又进一步激活了底侧膜上的Ca2+依赖性K+通道(BK通道)，K+随之流出细胞，使膜复极化，Ca2+通道失活；如果静毛束向对侧偏斜，K+循静纤毛上的m-e.t.通道外流，膜电位超极化。以后进入胞内的Ca

11、2+被结合缓冲，或被细胞膜上的离子泵或其它转运系统转运至胞外，从而Ca2+依赖性K+通道失活，最后膜电位恢复至静息水平。静纤毛上的m-e.t.通道通过使K+内流细胞去极化而形成的受体电位，是毛细胞完成机械-电转导过程的第一步。受体电位使L型电压依赖性钙通道开放，Ca2+内流，作为第二信使，引起毛细胞一系列反应，如调制依赖Ca2+的钾通道(钙离子激活的钾通道 Kn通道)活性，钙依赖性递质释放，OHC主动收缩反应，毛细胞的适应和电谐振等。较矮毛细胞的电谐振由BK通道参与完成。在靠近蜗顶的较高毛细胞，受体电位使L型电压依赖性钙通道开放的同时，缓慢激活外向延迟整流钾通道，K+缓慢外流，膜电位复极化。K

12、A表达的位置选择性与传出神经胆碱能突触在鸡基底乳头中的分布相应，因为矮毛细胞接受大多数的传出神经支配。矮毛细胞的KA在静息电位时完全失活，但胆碱能激动剂能使这些细胞膜电位超极化30mV，这个超极化解除了KA的失活状态，使KA能够在去极化电压刺激下被激活，在-56-44mV的电压范围内为细胞提供一个膜电导。这个电压范围内，其它电压依赖的离子通道是失活的，KA的激活可以增加膜电导，降低膜的时间常数，以便毛细胞在传出刺激的抑制性作用之后立即使细胞的膜电位更有利于声信号的输入。Kn通道被认为具有K+缓冲的功能，即将内淋巴中的K+转运至外淋巴。另外，越靠近蜗底的OHC，其IK,n幅度越大，IK,n使静息

13、电位时的输入电导增加，同时维持跨OHC顶端膜的最大K+驱动力。二钙离子与耳蜗毛细胞的功能钙离子对毛细胞完成各种生理功能非常重要，如机械-电转换、主动收缩反应、耳蜗的频率选择性、基底膜振动的非对称性及非线性反应，传出神经对内耳功能的调控等。1.钙离子与毛细胞的m-e.t.功能1.1钙离子直接参与毛细胞电谐振：从Hudspeth11提出的毛细胞电谐振的模型中可以看出，Ca2+内流意味着毛细胞激活，Ca2+外流Ca2+i降低则毛细胞恢复至静息电位。1.2钙离子调制毛细胞底侧膜上钙离子依赖的钾通道：毛细胞底侧膜上钙离子依赖的钾通道，如BK通道 SK通道 Kn通道的激活均需要Ca2+的存在。2.钙离子与

14、OHC的主动运动OHC的运动可分为胞体运动和纤毛束运动。前者根据机理的不同又分为两类：一类是电渗透性反应，可能不需要收缩蛋白的参与，而是与细胞侧壁某些结构的电机械特性相关的电致伸缩。例如，渗透压增高导致OHC缩短且体积增大；去极化时OHC伸长，超极化时缩短；交流电场引起OHC频率依赖性的机械响应，而且离体OHC的最佳响应频率与在体时的特征频率一致。OHC的另一类运动为肌性收缩，有肌性收缩蛋白的参与，需要钙离子的参与和能量供给。在用交流电引起OHC机械反应时，随着OHC电位的改变纤毛束也随之摆动，其响应频率跟得上OHC的特征频率。纤毛运动也需要钙离子的参与。耳蜗的毛细胞可能具有双向换能作用，即顺

15、向的机械-电转换：声波造成静纤毛的偏移，后者调制OHC的受体电位，改变其电化学状态；逆向的电-机械转换：电化学状态的改变又引起静纤毛的主动运动，将电位的变化转变成机械振荡。OHC的主动运动产生一个反馈环路影响Corti氏器的力学特性。3.钙离子与毛细胞m-e.t.的适应毛细胞m-e.t.的适应是指持久性的静纤毛束偏斜时，m-e.t.电流从峰值降到稳定值并伴有静纤毛束偏斜敏感位置的重新设置。适应形成的可能机制包括对顶端连接紧张度的连续调整和对静纤毛位置和劲度的调整。当Ca2+通过Ca2+通道进入静纤毛后，与钙调素结合，激活静纤毛内其它蛋白，导致肌动蛋白和肌球蛋白相互作用从而调节顶端连接紧张度。顶

16、端连接紧张度可因顶端连接沿静纤毛侧壁上下移动而改变，也可因m-e.t.通道由关闭转为开放引起的位移而下降。静纤毛位置和劲度的调整也是依赖于Ca2+进入静纤毛后激活一系列蛋白的结果。4.钙离子与毛细胞的神经支配：钙离子对耳蜗的传入和传出神经支配都是必需的。用高镁溶液灌注外淋巴时，耳蜗神经纤维的自发和声诱发电活动减少；用无钙溶液灌注时，自发和声诱发电活动完全消失；增加钙含量，自发和声诱发电活动也随之增加。钙主要通过控制递质的释放来影响电活动，内毛细胞的去极化导致电压依赖性钙通道开放，Ca2+内流Ca2+i升高，从而导致递质的释放。外淋巴中缺乏钙所致听神经单纤维响应阈的提高在特征频率处最明显，提示钙

17、离子对听神经频率选择性的形成也有重要作用。在耳蜗传出性神经递质和其它神经活性物质对OHC的作用中，Ca2+也起着不可替代的作用。无论是神经活性物质直接打开配体门控的离子通道，还是作用于胞内信使系统，Ca2+都参与了配体-受体-效应过程。三耳蜗内的神经活性物质1.乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)1959年Schuknecht提出乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)可能是耳蜗传出性神经递质的假说。首先，ACh符合神经递质的8个标准；传出神经的刺激作用可被胆碱能拮抗剂抑制；刺激传出神经后，外淋巴中ACh的含量增加；利用膜片钳技术记录到ACh介导的毛细胞的离子电流(IACh)；

18、用单细胞RT-PCR的方法，在大鼠OHC上克隆出ACh受体的9亚单位。来自于脑干中间上橄榄核或斜方体核的交叉和不交叉的橄榄耳蜗束构成豚鼠耳蜗的传出神经。绝大多数的传出神经支配OHC，还有一部分通过与传出神经建立的轴-树突触间接支配内毛细胞。传出纤维在耳蜗的分布密度不一致，耳蜗底周OHC接收的传出纤维较密，从耳蜗底周到顶周传出神经支配逐渐减少；越靠内排的OHC，接收的传出纤维越多。关于ACh对OHC的作用机制，目前有两种假说：(1)尼古丁受体/亲离子机制：ACh直接开放了OHC表面的尼古丁受体离子通道复合体，使Ca2+进入细胞内，然后激活了钙离子激活的钾离子通道，K+外流使OHC超极化。(2)毒

19、蕈碱受体/亲代谢产物机制：ACh作用于毒蕈碱受体，通过百日咳毒素敏感的G蛋白刺激肌醇磷酯系统，代谢产生的三磷酸肌醇使Ca2+从细胞内钙库释放，Ca2+激活了钙依赖的钾离子通道。OHC表面的ACh受体不能被尼古丁或毒蕈碱激动，但能被尼古丁和毒蕈碱的拮抗剂阻断，也能被士的宁(甘氨酸受体拮抗剂)阻断，也许其表面的ACh受体是一种新的类型。ACh作用于OHC的结果，是激活了钙离子激活的钾离子通道，K+外流使OHC超极化。Nenov等通过实验证明，K+是循SK通道而流出OHC膜外，这种通道对Cs+(大电导的钙离子激活的钾离子通道阻滞剂)通透。ACh使OHC超极化,相当于传出神经的活动将OHC的膜电位&q

20、uot;钳制"于接近钾离子平衡电位的水平(约-80mV)，后者超出了受体电位的激动范围，这样就使OHC拥有一个"电短路"(electrical shunt)阈，以致于在机械反馈环路中降低了OHC的能动反应性。刺激传出神经对OHC和初级传入神经有抑制作用，耳蜗的频率选择性下降；内侧橄榄耳蜗束传出纤维使畸变产物耳声发射(被认为是OHC功能的选择性测试方法)受到抑制。电生理的实验结果，必然要能够说明生理活动现象，ACh使OHC的超极化,如何影响耳蜗机制，在正常的听生理中有何意义，还有赖于进一步的电生理和听生理的实验研究来揭示。2.三磷酸腺苷(adenosine trip

21、hosphate，ATP)长期以来，耳蜗中ATP的来源一直是一个悬而未决的问题。目前认为，耳蜗内的ATP是由其中的细胞自分泌产生的。White等发现，豚鼠血管纹的边缘细胞内有富含嘌呤的囊泡。电刺激离体的Corti氏器后，灌流液中有腺苷(ATP的代谢产物)的聚集。内源性的ATP在内淋巴液和外淋巴液中的浓度分别为13nM和10nM，短暂的缺氧使外淋巴液中的ATP浓度成倍增长，只有通过囊泡储存的释放才能在局部形成这样高的浓度水平。也不排除ATP作为胆碱能突触传递的神经调质，与ACh一起释放的可能性。ATP受体在耳蜗中的分布非常广泛，如在血管纹的边缘细胞，Reissner膜的上皮细胞，螺旋韧带，螺旋神

22、经节细胞等都有分布。就OHC来说，有两种类型的受体分布于细胞的两极。P2X2受体位于OHC的静纤毛，直接门控阳离子通道，使K+从中阶的外淋巴流入细胞内，OHC去极化。这种阳离子通道对Ca2+高通透，在ATP作用下OHC内Ca2+浓度增加。P2Y受体分布于OHC底侧膜表面，ATP与其结合后，通过百日咳毒素敏感的G蛋白-磷脂酶C-三磷酸肌醇通路起作用，自细胞内钙库释放Ca2+，后者直接调制钙依赖的离子通道，如Kn，BK，SK，钙激活的非选择性的阳离子通道。ATP门控的离子通道在靠近底周的OHC静纤毛上表达密度较高，估计有16500个通道分布于底周的OHC，而顶周的OHC上只有6000个。ATP对O

23、HC的作用很复杂，很多问题也还未阐明。总的来说，ATP作用于P2X2受体或P2Y受体，使Ca2+内流或自细胞内钙库释放，细胞内的Ca2+浓度升高，激动了许多分布于底侧膜表面的钙依赖的离子通道，使细胞的膜电位发生改变，从而直接调制OHC的电机械反馈过程(逆向转导)。所以，P2X2受体能够直接影响声转导过程，而P2Y受体则介导传出神经的传导或对围绕OHC侧膜的Nuel间隙中的ATP的变化起反应。另外，与OHC关系非常密切的Deiters细胞表面也有P2X2受体，其主要作用是改变Deiters细胞的机械顺应性。四耳蜗活动的机制通过以上的描述，我们对耳蜗毛细胞的机械-电转换形成感受器电位，顶端和底侧膜

24、上存在的离子通道的功能，钙离子对毛细胞功能维持的重要性，传出神经递质ACh和神经活性物质ATP对OHC功能的调制有了一定的认识。这部分我们将谈谈耳蜗的频率选择性(频率调谐)，基底膜振动的非对称性及非线性反应。对耳蜗频率分析的理解经历了三个主要的时期，即四十年代晚期以前，Helmholtz的轻减振空间定位机械共振单元执行频谱分析学说，四十年代晚期到七十年代早期Von Bekesy的行波学说和发展于七十年代和八十年代早期的耳蜗放大器学说。Von Bekesy的行波理论来自于对尸体耳蜗基底膜振动的测量，只能算作是对基底膜固有物理性状的分析，因为据此理论，基底膜振动与声刺激之间的关系是线性的。目前认为

25、，对声频谱粗浅的"预处理"，行波理论是可行的。如果要获得如哺乳动物般，在很宽的频谱范围内，具有高灵敏度高选择性的听力水平，就需要一个主动的放大过程在局部加强行波。1.耳蜗的频率调谐因为通常我们所听到的声音并不是纯音，所以内耳听器不但要能感受到声刺激，而且要将这些声刺激解析成一系列构成频率。毛细胞只对特定范围内的频率反应，而排除超出这个范围的噪声成分。所以频率调谐不仅是一种分析复杂信号的方式，也是降低噪声的手段。在听阈范围内，声波的频率与耳蜗内的感受位点(毛细胞)一一对应，所以构成了一幅频率-位点图(frequency-place map)。频率-位点图的物理基础首先依赖于基

26、底膜的纵向劲度成分。除此之外，耳蜗毛细胞的空间大小，传出神经的支配密度，嘌呤受体的密度，OHC的输入电导等沿耳蜗长轴存在着系统差异。我们已经知道，哺乳动物的耳蜗从底周到顶周，OHC的长度逐渐增加，同时耳蜗每一周第1排到第3排OHC的长度逐渐减小。也就是说，沿耳蜗基底膜，OHC的空间大小(dimension)存在着系统的顺延的变化。但是相同长度的OHC可以来自于基底膜的不同位置。例如，Pujol等介绍，尤其是长度介于3055m之间的OHC可以属于第4周第1排，也可以属于第2周第3排。Mammano和Ashmore在完整的Corti氏器上运用膜片钳技术研究豚鼠耳蜗第2第3第4周的第3排OHC(为分

27、别接收7kHz 2kHz 0.5kHz声波的位点)的电生理特性，发现零电流电位最大膜电流最大斜电导从耳蜗第2第3到第4周逐渐减小，而膜电容输入阻抗漏电导(代表非选择性离子通道)则相反，勾画了一个OHC电生理特性的"频率-位点图"。传出神经的支配密度和嘌呤受体的密度沿耳蜗长轴存在的系统差异前已述及。系统差异的存在使耳蜗成为一个复杂的精细的高度敏感的空间结构。耳蜗频率调谐的核心是毛细胞。哺乳动物耳蜗的内毛细胞与绝大多数的传入神经末梢形成突触连接，作为初级转导器处理中耳传入的声波信号(顺向转导)，执行单纯的感觉功能。而OHC具有主动运动的功能。OHC周围存在着明显的细胞外隙，仅细胞底部和顶端固定，即使在活体内，也允许其有一定程度的自由活动性。电刺激可诱发快速运动，而膜电位去极化机械刺激化学药物(如ATP)胞内钙离子浓度则可使OHC缓慢运动。OHC受声介导的转导器电流诱发而形成受体电位后，引起自身长度改变(机械反馈，逆向转导)，从而调节和加强基底膜的振动。Mammano等在完整豚鼠耳蜗Corti氏器上运用膜片钳技术研究表明，使单个OHC膜电位去极化而引起