Neon-细胞电转仪中文说明书(MPK5000)

1、Neon-细胞电转仪中文说明书（MPK5000）一，简单的3步骤程序。1 .将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA,RNA,siRNA）的混合物加入到提取物中。2 .将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中；在设备上选择程序，然后按开始。3 .拔下移液器,将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。注：1.为了避免污染，强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA/siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液4 .为了确保重复性和排除转染条件的变化，建议不要使用枪头超过2次二，软件操作程序1 .按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon®设备。本机检查确保N

2、eon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。2 .按Voltage启动数字键盘输入电压值。按所需的电压值，然后按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制，则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。3 .按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。4 .按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值,然后按Done保存该值。5 .如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的“Save”将程序保存在数据库中。6.按所需的程序号码编辑程序。选定的程序会突出显示。7.显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。光标自动移动到下一个字段协议，并突

3、出显示为红色。继续输入Voltage,Width和Pulses信息。8O按Enter键将信息保存在数据库中。9.继续准备细胞和DNA,并设置用于电穿孔的移液器座三，细胞与DNA混合物准备注意事项：1 .将纯化的DNA重悬于1-5ug/uL浓度的去离子水或TE缓冲液(lOmMTrisHCLImMEDTA,pH8.0)中。浓度可能因细胞类型而异。2 .DNA量不应超过使用总体积的10%。3 .通过测量A260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。电穿孔的比例应至少为L8。4 .该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。使用大于20kb的质粒很可能降低转染效率。5

4、.不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。6 .不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）流程：1 .用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E,10uLNeon®Tip和BufferE2,100uLNeon®Tip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。）2 .将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接（见下图左侧正确位置）Sideelectrode3 .在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的

5、培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90%汇合。4 .对于大多数优化协议，每10PLNeonTip可提供5X104-2XIO,个细胞。（5X105-2X10$个细胞每lOORLNeonMip适用于大多数优化的方案。）5 .将含有血清，PBS（不含Ca2+和Mg2+）和胰蛋白酶/EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37o从培养瓶中吸出培养基,并使用PBS（不含Ca2+和Mg2+）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到L5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下

6、以100-400Xg离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400Xg离心5分钟，用PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗细胞。吸出PBS并以1.0X107个细胞/mL的最终密度将细胞沉淀重悬于ResuspensionBufferR中。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。6 .通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板,不用抗生素，并在潮湿的37/5%CO2培养箱中预培养板。如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议

7、。7 .对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液FormatCellTypeDNA(pg)siRNA(nM)Neon*TipVol.platingmediumCellno.BufferRorBufferT，96-wellAdherent0.25-0.510-20010pL100pL1-2x10410pL/wellSuspension0.5-1WjjLD2-5x10410pL/well48-wellAdherent0.25-110-20010pL250pL2.5-5x10410pL/wellSuspensio

8、n0.5-210pLD5-12.5x10410pL/well24-wellAdherent0.5-210-20010pLD500pL0.5-1xIO510pL/wellSuspension0.5-310pL1-2.5x10510pL/well12-wellAdherent0.5-310-20010pL1mL1-2x10510pL/wellSuspension0.5-310pL2-5x10510pl_/well6-wellAdherent0.5-3(10pL)5-30(100pL)10-20010pL/100ML2mL2-4x10510pLor100pL/wellSuspension0.5-3(

9、10pL)5-30(100pL)lOpL/IOOpL0.6-1x10610pLor100pL/well60mmAdherent5-3010-200(rgopL5mL0.5-1x106100pL/wellSuspension5-3000pL1-2.5x106100pLjwell10cmAdherent5-3010-200EDOpL10mL1-2x106100pL/wellSuspension5-3000pL2-5x106100pL/well8 .使用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E,10ULNeon®Tip和缓冲液E2,100uLNeon®Tip)装入Neon®移液管

10、9 .根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件10 .将适量的质粒DNA/siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。11 .将细胞加入到含有质粒DNA/siRNA的管中，轻轻混合。请参见上表，了解细胞浓度，DNA和电镀量。12 .要将NeonMip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具13 .将Neon®移液器的顶部插入NeonTip,直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）14 .轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。注意：确保Neon®移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和

11、正确的电气连接15 .将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA/siRNA混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA/siRNA混合物吸入Neon®Tip。W在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。airbubbles16 .将带有样品的Neon噜液器垂直插入放置在Neon噂液器站中的Neon®Tube,直至听到咔嗒声。确保移液器突起插入吸液管的槽中。17 .确保Neon®移液器的金属头与Neon

12、®移液器支架内的球形活塞和Neon®Tube（见左图所示的正确位置）紧密连接。18 .在传送电脉冲之前，Neon®设备会自动检查Neon®Tube和Neon®Pipette是否正确插入。19 .在电穿孔期间监测Neon®Tip,以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。电弧导致转染效率低，细胞活力低。20 .交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。21.从Neon®移液器站慢1移除Neon®移液器，并立即从NeonTip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养

13、基中。22 .我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。23 .要放弃Neon®Tip,请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。24.对剩余的样品重复步骤7-16o使用两次后，请务必更换Neon®Tips,并在10次使用后更换Neon®Tubes。每个新的质粒25.轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。在37下在加湿的C02培养箱中孵育该板。注意1.如果您没有使用Neon®设备，将后面的电源开关转到OFF位:2 .避免在Neon®移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。3 .如

14、果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon®移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。优化流程Cell UneAdherentExamples Include: CEM, HL-60, K-562, Jurkat LCL, Ramos, U-937Cen TypePrimary CellsSuspensionAdherentSuspension1 .确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA,并制备含有0.5mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。准备足够的细胞和质粒DNA/s

15、iRNA进行至少30次转染。2 .对于使用24孔格式的10ULNeon®Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。对于以24孔格式使用lOOuLNeonQip,请将下表中列出的数值适当调整10倍。CelltypeCellno.DNAsiRNAResuspensionBufferRAdherent1x105/well0.5pgDNA/well15pg/plate50pmolin10pLtip100nMperwell10pL/well285pL/plateSuspension2x107well1pgDNA/well30pg/plate100pmolin10pLtip200nMperwell10

16、pL/well270pL/plate缓冲液E2,100uLNeon®Tip）置于含有细胞DNA/siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15页所述。4 .按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。SampleWellno.PulsevoltagePulsewidthPulseno.ResultsTransfectionefficiencyCellviability1A1Usepre-optimizedparameterorcontrolwithoutelectroporation.2A214002013A315002014A416002015A5170020i6A611003017B112003018B2130030iqB3140030110B4100040111B511CO40112B6120040113C1110020214C212C020215C3130020216C4140020217C58503021BC695030