大肠杆菌中表达和纯化水稻穗颈伸长基因EUI2及其-BioPublisher

1、在大肠杆菌中大量制备和纯化水稻环氧化物酶汪社亮 13，柳参奎 2，玉光惠 1，巩鹏涛 12，赵德刚 1，方宣钧 1,31.海南省农作物分子育种重点实验室，海南省热带农业资源开发利用研究所, 三亚 , 572025, 中国2.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心, 哈尔滨 , 150040, 中国3. 贵州大学生命科学院 , 贵州省农业生物工程重点实验室 , 贵阳 , 550025，中国通讯作者及电子邮箱作者电子邮箱基因组学与应用生物学，2010 年，第 30 卷，第 1 期DOI:收稿日期： 2010年 7月 28日接受日期： 2010年 8月 15日发表日期： 2010年 9月 10日这是

2、一篇开放阅取的论文，其论文发布和传播接受Creative Commons Attribution License 所有条款。只要对本原作有恰当的引用，版权所有人允许和同意第三者无条件的使用、传播以及任何媒介的复制或再制作。本文首次发表在 Bioscience Methods 开放取阅期刊上。 本文是依据 Creative Commons Attribution License 协议，用中文再次发表与传播，如果读者对中文含义的理解有歧义，请以英文原文为准。如果任何人要引用本研究内容，建议的引用格式如下：Wang et al., 2010, Large Preparation and Purifi

3、cation of Rice Epoxide Hydrolase Expressed inEscherichia coli , Bioscience摘要我们采用反转录PCR方法从水稻基因组cDNA 文库中扩增 OsEH1 基因，构建重组质粒pQE-30+OsEH1 质粒，转入大肠杆菌E. coli M15细胞中进行表达，表达出含有6个 His标签的融合蛋白6xHis- OsEH1 。优化了 IPTG 浓度和培养温度获得 6xHis- OsEH1 融合蛋白大量表达。利用 Ni-NTA 树脂亲和色谱柱，通过改进表达和纯化过程， 最终每升菌液可获得分子量大约为 36 kDa的纯化的融合蛋白 7.46

4、 mg 。该方法获得的纯化蛋白能够满足进一步的蛋白活性鉴定和抗体制备等工作。关键词水稻 , 环氧化物酶；OsEH1基因；蛋白纯化；大量制备Large Preparation and Purification of Rice Epoxide Hydrolase Expressed in Escherichia coliSheliang Wang 13LiuShenkui 2Guanhui Yu 1Pengtao Gong1Degang Zhao3Xuanjun Fang131. Hainan Key Lab of Crop Molecular Breeding, Hainan Institute

5、 of Tropical Agricultural Resources, Sanya, 572025, China2. Alkali Soil Natural Environmental Science Center (ASNESC), Northeast Forestry University, Harbin, 150040,China3. Guizhou Key Lab of Agro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang, 550025, ChinaCorresponding authorAutho r s emailAbstractA

6、rice gene, OsEH1, was amplified by PCR from the cDNA library of japonica rice Nipponbare,The gene was ligated to into expression vector pQE30 to construct expression vector pQE30-OsEH1, whichwas transformed to competent cell ofEscherichia coliM15. The recombinant epoxide hydrolase labeled withsix Hi

7、s was expressed in the host of Escherichia coli M15. In this study, a large quantity of 6xHis fusionprotein 6xHis- OsEH1 were expressed by optimizing the IPTG induction concentration and cultural temperature, and we harvested about 7.46 mg of pure 6xHis- OsEH1 fusion proteins with the mass of 36kDa

8、per litre, whichwas fractioned by Ni-NTA resin affinity chromatography. It is shown that the procedures expression and purification for rice epoxide hydrolase might meet the requirements for further studies on the antibodypreparation and protein activity identification.Keywords Epoxide hydrolase; Os

9、EH1 ( Oryza sativa Epoxide Hydrolase 1) gene; Protein Purification; Large preparation环氧化物酶 (epoxide hydrolase, EH) 以其在药物代谢之解毒功能著称，该酶在生物体内通过加入水分子可催化环氧化物生成邻位二醇，从而使这些物质从体内排出(Archelasand Furstoss, 1998;Rehm,2001) 。植物中已经鉴定出EH 的物种有10 种以上，多数环氧化物酶是可溶性的，多为分子量35 kDa 左右的 a/? 型同工酶 (Summerer et al., 2002) ，大量存在于

10、细胞的内质网。马铃薯中的EH 的研究相对较多，已获得该酶在结构和功能上的一些新发现(Mowbrayet al., 2006; Lindberg et al., 2010; Widersten et al.,2010) 。我们前期的研究已经获得一个水稻环氧化物酶基因OsEH1 (Oryza sativa Epoxide Hydrolase 1)，该基因由一个 933 bp的 ORF编码 311个氨基酸序列，在原核菌株E.coli M15 中，诱导表达蛋白大小约为36KDa( Wang et al., 2010)。然而， 关于水稻环氧化物酶的研究报道甚少，要研究这种酶蛋白的功能及结构，异源的表达、

11、纯化和大量制备可溶蛋白是十分重要的。在本研究中，我们采用反转录PCR方法从水稻基因组cDNA 文库中获得了OsEH1基因，并且利用大肠杆菌表达系统表达目的基因， 通过优化条件获得了理想的高纯度的可溶性目的蛋白， 为进一步研究水稻可溶性环氧化物酶的生物学功能提供了基础。1结果与分析1.1 OSEH1 基因的克隆和表达质粒的构建本实验我们采用反转录PCR 方法从水稻品种日本晴 cDNA 文库中获得了 OsEH1 基因，琼脂糖凝胶电泳分析能清晰的看到目标条带。PCR 产物经过连接转化， 获得有重组质粒的转化菌株，试剂盒提取质粒 DNA ，用载体上含有而目标基因不具有的KpnI 和 SalI 限制性内

12、切酶双酶切进行鉴定，证实所得的序列已经成功的连接到pMD18T 载体中。对所得重组菌株进行序列测定(华大基因 )，测序结果显示与推定的 cDNA 片段序列信息完全吻合， 没有移位、终止密码或重排的发生。表明我们用 PCR 扩增获得的 DNA序列是我们期望的全长基因序列，重组质粒命名为pMD18T+ OsEH1。将质粒 pMD18T+ OsEH1 和表达载体 pQE30经 KpnI 和 SalI 限制性内切酶双酶切， T4 连接酶连接之后，通过复制菌株 EcoliJM109的复制，双酶切鉴定正确，从而获得了重组质粒pQE30+ OsEH1 质粒。转入大肠杆菌 E. coli M15细胞中进行表达

13、。1.2 6xHis-OsEH1 融合蛋白的表达优化我们的前期研究初步表明，6xHis-OsEH1 融合蛋白在 IPTG 浓度为 0.1 mmol/L 获得了良好的表达，融合蛋白的总量在 IPTG 加入的 3hr之后有了显著的增加，同时在表达时间2.5 h 之后，非降解融合蛋白表达量已经达到最高水平（ Wang et al.2010） 。为了寻求获得理想的表达优化条件， 我们分析了不同 IPTG 浓度和不同培养温度对融合蛋白表达的影响。 IPTG 浓度选为 (0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L 和 1.0 mmol/L) 温度选为 (18 °C, 20 °C, 2

14、3 °C 28°C, 30 °C和37 °C)。试验表明， 在 28°C以上不同的 IPTG 诱导剂的浓度对融合蛋白表达总量的影响不是很大，而且 30°C和 37 °C的温度下并不能获得期望的可溶目的产物。显然，高浓度IPTG 和高温度条件下有可能导致蛋白以不可溶的形式存在于细胞中（图1）。为此，我们选取(18 °C,20°C和 23°C) 作为候选优化表达温度。图 16× His-OsEH1 重组蛋白诱导温度，诱导剂浓度梯度SDS-PAGE 分析M 为蛋白分子质量标准Fig.1 SD

15、S-PAGE analysis of 6 ×His- OsEH1 fusion protein expressed in the different emperature and IPTG gradientM ： protein molecular mass standards我们在设定的诱导剂浓度和设定的温度条件下，在菌株细胞生长曲线对数中期诱导表达融合蛋白的菌株 (图1) 。在较低的温度下(18 °C和 20 °C)，不能获得大量表达的可溶性的融合蛋白大多数融合蛋白(图1, A 和 B; 泳道 13), 同时有明显的非特异结合蛋白被洗脱出来，影响了目的融合蛋白

16、的纯度(图 4)，然而在较高的 23°C条件下， 各个 IPTG 浓度下可溶性蛋白表达量显著增加(图 4C, 泳道 1-3)，因此，最终比较理想的优化条件是： IPTG 浓度为 0.1 mmol/L 或 0.5 mmol/L ，温度为 23°C，在该条件下，有利于融合蛋白的表达和纯化。图1 不同 IPTG 浓度和培养温度对可溶6xHis-OSEH1 融合蛋白表达的影响M:蛋白分子质量标准; A: 1-3:温度为 : 18 C,° IPTG 浓度为 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1.0 mmol/L; B: 13:温度为 20°C, IP

17、TG浓度为 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L; C: 1-3:温度为 23°C, IPTG 浓度为 0.1mmol/L, 0.5mmol/L 和1.0 mol/LFigure 3 Effects of induction temperature and IPTG concentration on the expression of soluble 6xHis-OsEH1 fusion proteinsM: Protein molecular mass standard; A: 13: Temperature 18C, IPTG concentrat

18、ion° 0.1mmol/L,0.5mmol/L and 1.0 mmol/L; B:lane 13: temperature 20 C, IPTG° concentration 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/L; C: 13: Temperature 23C, IPTGconcentration 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/L°1.36xHis-OsEH1 融合蛋白的纯化制备以往的研究表明，咪唑浓度影响蛋白的纯化效率。中低浓度的咪唑不影响蛋白纯化的效率，而高浓度时，非变性条件纯

19、化比变性条件纯化具有更高的背景杂蛋白污染。因此，本研究选择在Lysis buffer 和Wash buffers 中咪唑浓度分别为10 mmol/L 和 20 mmol/L 。试验结果显示，在20°C和 23°C时非特异蛋白仍然强烈的与融合蛋白共洗脱(图 1B,C) 。为此，我们将预洗柱子的Wash buffer 中 NaCl 的浓度从 300 mmol/L提高到 1mol/L ，由此洗脱出来的的6xHis-OsEH1融合蛋白具有较高纯度的单一蛋白样品(图 2)。研究结果直接表明提高Wash buffer 中 NaCl 的浓度能很好的减轻杂蛋白的污染。图2 6xHis-Os

20、EH1 融合蛋白洗脱样 SDS-PAGE 分析注: 经 1 mmol/L NaCl 预洗之后所得 6xHis- OsEH1 融合蛋白洗脱样 12.5% SDS-PAGE 胶分析 , 各样等体积加入 ; M: 蛋白分子质量标准 ; A: 13: 温度为 20°C, IPTG 浓度为 0.1 mmol/L ,0.5 mmol/L 和 1.0 mmol/L; B: 1: 未加 IPTG诱导剂诱导的纯化结果; 24 : 温度为 23°C, IPTG 浓度为 0.1 mmol/L,0.5 mmol/L 和1.0 mmol/LFigure 2 SDS-PAGE analysis of

21、Eluted fractions of 6xHis- OsEH1 fusion proteinNote: After prewashing with 1 mol/L concentration of NaCl using the Ni-NTA matrix column, equal volumes of elution fractions were separated on a 12.5% SDS-PAGE gel; M: Molecular mass standards; A: 1-3: Temperature 20 C, IPTG concentration° 0.1 mmol

22、/L, 0.5 mmol/L 和1.0 mmol/L; B: 1: Purification without IPTG induced; 24: Temperature 23 C, IPTG concentration° 0.1 mmol/L, 0.5 mmol/L and 1.0 mmol/LSDS-PAGE（胶浓度12.5%）分析显示该融合蛋白分子量大小约为 38 kDa左右，大于通过依据其编码的氨基酸序列推定的蛋白分子量35.9 kDa，这可能是由于在酶蛋白在异源表达环境未进行转录后剪辑造成的（ Post-translational cleavage）。依据 SDS-PAGE

23、分析结果 (图 2B, 泳道 3) 6xHis-OsEH1 融合蛋白纯度最高达 91.7% (表 1)。依上所述之方法，我们将 1 L 细胞表达液经离心收集 (湿重约为 1.74 g) ，经溶菌酶破碎，预洗液预洗，最后进行洗脱目的融合蛋白。参照标准曲线计算三次重复试验的平均结果，最后得到pQE30+ OsEH1 重组蛋白在 OD595nm 处的平均吸光度为 0.4837，根据公式 y=0.0125x+0.0175 ，求得 x=37.296 ，则重组蛋白实际浓度为C=37.296/5=7.46mg/L ，最终从1 L 表达菌液中，我们获得了7.46 mg 的高浓度的 6xHis-OsEH1蛋白

24、(表1)纯化得到的蛋白足够用于活性特性研究和制备抗体。表1 大量制备 6xHis-OsEH1 过程总结Table 1 Summary of the large preparation for 6xHis-OsEH1样品物可溶蛋白 (mg)纯度 a (%)Fraction sample (mg)Soluble protein (mg)Purity a (%)细胞湿重1740.091.7Wet weight cells collected可溶蛋白样Soluble protein fraction纯化的 6xHis-OsEH1 融合蛋白 Purified 6xHis-OsEH1 fusion pro

25、tein92.007.46注: a: Tris-Tricine SDS-PAGE 胶进行光密度分析 6xHis-OSEH1 融合蛋白纯度 (图 4, 泳道 6), 数值表示最高的蛋白样品纯度Note: a: The purity of the 6xHis- OsEH1 protein was assessed by densitometry analysis of the Tris-Tricine SDS-PAGE shown in Figure 4, lane 6, and the value is that for the most pure fraction2讨论在功能基因组学研究中，

26、基因的表达及其编码蛋白的纯化是进一步获知编码蛋白的结构和功能的有效手段。在前人的研究中， Lu等 (2005) 人在大肠杆菌中成功表达了水稻中分离获得的两种抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbate peroxidase, APX) ，融合蛋白分离纯化后的实验推断出这两种同工酶具有不同的性质。Yu 等(2007) 人利用大肠杆菌表达系统进行了水稻中碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA) 融合蛋白的表达， 并通过优化 IPTG 浓度和不同培养温度，获得了高纯度的目的蛋白，为该酶的酶活特性等实验提供了很好的试验样品。同样，在本研究中，我们实现了水稻OSEH1基因编码蛋白的原核表达，

27、并且以6xHis-OSEH1融合蛋白的形式获得了高纯度的毫克级蛋白样品。本研究中所获的蛋白足够提供下游兔抗体的制备和蛋白三维结构的分析，因而将有助于揭示OsEH1 基因在水稻体内参与环氧化物代谢途径，调控水稻生长发育的生物学。3 材料与方法3.1 植物材料、试剂与菌株水稻品种日本晴(Nipponbare.);反转录 AMV 试剂盒、 PCR试剂盒、 pMD18-T 试剂盒及限制性内切酶据来自 TaKaRa公司，其他一些常用试剂来自国内外生物试剂公司；复制菌株E. coli JM109 、表达载体pQE-30 和表达菌株 E. coli M15 。3.2 OsEH1 基因的克隆和表达质粒的构建O

28、SEH1 编码的外显子全序列通过多聚酶链式反应(PCR)扩增，程序为： (94 °C 2 min, 94 C °40s, 54.5 C °40s, 72 C°90s; 30 cycles) 所用引物为： F:5- CGGGTACC ATG GATCAGAGGA TTG-3 ( KpnI) R': 5- CGGTCGAC TCA TGCA TGTTTACTG-3 ( SalI ) 。通过 pMD18T 载体获得正确的质粒，用相应的限制性内切酶处理质粒和表达载体 pQE30，T4 链接酶连接过夜并转入 E. coli JM109 菌株中获得正确的表达

29、质粒pQE30-OsEH1 。以大肠杆菌 E. coli M15 为宿主细胞转入含有 pQE30-OsEH1 的质粒，用于表达含有 6个 His 标签的融合蛋白。3.3 含有 6xHis标签的 OsEH1 融合蛋白的表达优化用 IPTG (isopropyl-D-thiogalactoside) 为诱导剂诱导表达转入pQE30- OsEH1质粒的大肠杆菌E. coliM15 。以不加诱导剂为对照，分别于诱导剂加入后0.5 h, 1.0 h, 1.5 h, 2.0 h, 3.0 h 和 4.0 h取出菌体离心冰浴保存，待所有菌样收集齐全各加等量细胞裂解磷酸盐缓冲液PBS和上样缓冲液，100 &#

30、176;C沸水中5 min，快速离心， 12.5% SDS-PAGE 胶分析蛋白样。3.4 含有 6xHis标签的 OsEH1 融合蛋白的大量制备大量制备 6xHis-OSEH1 融合蛋白描述如下：30mlLB 培养基 (100 ug/ml ampicillin 和 25 ug/mlKanamycin) 37 C °适当的旋转速度恒温箱中培养过夜表达菌株。 取 10ml 培养过夜液加入到含有相应抗性的 1 L LB 培养基中， 37 °C 培养 1 h，待生长曲线对数中期 OD 600 0.6时，加入诱导剂 IPTG ，使得 IPTG最终浓度达到 0.1 m/mol ， 2

31、3 °C继续培养 3.5h，收集细胞， 6000g高速离心 5min，去上清用经预冷的 Lysis buffer (50 m/mol NaH 2PO4; 6.90 g NaH 2PO4·H2 O (MW 137.99 g/mol) 300 m/mol NaCl, 17.54 g NaCl (MW58.44 g/mol) 10 m/mol imidazole, 0.68 g imidazole (MW 68.08 g/mol) pH 8.0) 15ml重悬菌体， 同时加入溶菌酶，使溶菌酶的终浓度达到1 mg/ml 。3.5 含有 6xHis标签的 OsEH1 融合蛋白的纯化将

32、重悬液置冰上 30 min ，然后 4 °C， 15 000 g 高速离心 30 min 。取离心后包含 6xHis-OsEH1 融合蛋白的上清液， 加入到预先经 Lysis buffer 平衡了的 Ni-NTA 树脂亲和色谱柱上。 树脂亲和柱的结合蛋白能力大概为 5mg/ml ，非特异结合蛋白最终通过 Washing buffer (20 mmol/L imidazole, others according to Lysis buffer) 洗去，含有 6xHis 标签融合蛋白则被 Elutionr buffer (250 m mmol/L imidazole,others acc

33、ording to Lysis buffer) 洗脱下来。蛋白样通过 12.5%SDS-PAGE 胶分析，用考马斯亮蓝 R-250 (CBB) 染色，蛋白质浓度测量使用 BCA Protein Assay Kit (Pierce) 。3.6 BSA 标准曲线制作以 1mg/ml 的 BSA 依次从 0ul 、5 ul 、10 ul 、20 ul、30 ul、40 ul 、5 0 ul增加， Elution buffer 依次从 50 ul、45 ul 、 40 ul、30 ul、 20 ul、 10 ul、 0 ul 减少分别加入到 1cm的比色皿中，各加入2.5ml的 CCB-G250 混匀

34、，分光光度计测得各标准样的OD595 值，每组重复三次。 浓度测定， 取待测蛋白样 5ul替代 BSA 加入上述体系，分光光度计测其OD595值，重复三次。BSA蛋白标准曲线y = 0.0125x + 0.01750.7R2 = 0.97460.6） 0.5mn0.4系列15950.3线性 ( 系列1)(D0.2O0.100 浓度（ ug）图 3-8 BSA 蛋白标准曲线Fig.3-8 BSA protein standard curve作者贡献汪社亮、柳参奎是本研究的实验设计和实验研究的执行人；汪社亮、玉光惠及巩鹏涛完成数据分析，论文初稿的写作；赵德刚参与实验设计，试验结果分析；方宣钧和柳参

35、奎是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。致谢本研究受国家科技支撑计划(2007BAD59B05) 的资助。作者感谢东北林业大学盐碱地资源环境研究中心张欣欣博士在本实验过程中的技术支持和有益的建议。 感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。参考文献Archelas A., and Furstoss R., 1998, Epoxide hydrolases: New tools for the synthesis

36、of fine organic chemicals,Trends Biotechnol., 16(3): 108-116Edqvist J., and Farbos I., 2002, Characterization of germination-specific lipid transfer proteins from Euphorbialagascae, Planta, 215(1): 41-50Heredia A., 2003, Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolyme

37、r, Biochim.Biophys. Acta,1620(1-3): 1-7Kessler A., Halitschke R., and Baldwin I.T., 2004, Silencing the jasmonate cascade: induced plant defenses andinsect populations, Science, 305(5684): 665-668Lu Z.Q., Takano T., and Liu S.K., 2005, Purification and characterization of two ascorbate peroxidases of rice ( Oryza sativa L.) expressed in Escherichia co li, Biotechnology Letters, 27(1): 63-67Lindberg D., Ahmad S., and Widersten M., 2010, Mutations in salt-bridging residues at the interface of the core and lid domains of epoxide hydrolase StEH1 affect regiosele