奈比洛尔抑制AngⅡ高糖诱导HK-2细胞上皮—间质转化的机制

1、奈比洛尔抑制Ang / 高糖诱导 HK-2 细胞上皮间质转化的机制目的 : 探讨奈比洛尔抑制血管紧张素（Ang） / 高糖诱导人肾小管上皮细胞（ HK-2 细胞）上皮 - 间质转化（ EMT）的作用及机制 , 为肾小管间质纤维化的治疗提供新思路。方法 : （一）预实验确定Ang/ 高糖诱导 HK-2 细胞 EMT的适宜浓度及时间。（二）奈比洛尔抑制Ang/ 高糖诱导 HK-2 细胞 EMT的作用。奈比洛尔抑制Ang诱导 HK-2 细胞 EMT分组如下 : 空白对照组 ;Ang （ 10^-66 mol/L ）组 ; 奈比洛尔不同浓度（ 1,5,10,

2、20 mol/L ）和时间（ 30min,1.5h,3h ）预处理组。奈比洛尔抑制高糖诱导 HK-2细胞 EMT分组如下 : 空白对照组 ; 渗透压对照组 ;高糖（ 30 mmol/L ）组 ; 奈比洛尔不同浓度（ 1,5,10,20 mol/L ）和时间（ 30min,1.5h,3h ）预处理组。荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS） , 划痕实验测细胞迁移能力 ,Western Blot检测细胞 -SMA,CollagenI,Vimentin,Fibronectin和 E-Cadherin 蛋白表达。（三）奈比洛尔抑制Ang/ 高糖诱导 HK-2细胞 EMT的机制。分组如下 : 空白对照组

3、; 空白对照 +奈比洛尔（10mol/L,1.5h ）组;Ang （10^-66mol/L,48h ） / 高糖（ 30 mmol/L,48h ）组 ; 奈比洛尔（ 10mol/L,1.5h ）+Ang（ 10^-66 mol/L,48h ） / 高糖（ 30 mmol/L,48h ）组 ; 空白对照 +二苯基氯化碘盐（ DPI）（1 mol/L,1.5h ）组 ;DPI （1mol/L,1.5h ） +Ang（ 10^-66 mol/L,48h ）/ 高糖（ 3

4、0 mmol/L,48h ）组。荧光探针法检测细胞内 ROS,Western Blot 检测细胞 NADPH氧化酶（ NOX）2,NOX4,p22^phox,AMPK,p-AMPK,TGF-₁,ERK1/2,p-ERK1/2 蛋白表达。（四）奈比洛尔抑制转化生长因子（ TGF- ₁）诱导 HK-2 细胞 EMT的作用。分组如下 : 空白对照组 ; 空白对照 +奈比洛尔（ 10mol/L,1.5h ）组 ;TGF- ₁

5、;（ 10ng/mL,48h）组 ; 奈比洛尔（ 10mol/L,1.5h ）+TGF-₁组 ; 空白对照 +DPI（1 mol/L,1.5h ）组 ;DPI（1mol/L,1.5h ）+TGF- ₁组。划痕实验测细胞迁移能力 ,Western Blot 检测细胞 -SMA,E-Cadherin,Collage I,Vimentin和 Fibronectin蛋白表达。结果 :（一）Ang（ 10^-66 mol/L,48h ）或高糖（30 mmol/L,48h

6、 ）促进 HK-2 细胞内 ROS生成 , 下调 E-Cadherin 蛋白表达、上调 -SMA蛋白表达 ,诱导细胞 EMT。（二）奈比洛尔10 和 20mol/L 作用 1.5 和 3 h 可抑制 Ang/高糖诱导的 HK-2 细胞内 ROS生成 , 但两个浓度在相同时间点无显著性差异。奈比洛尔 10mol/L 作用 1.5h 可明显抑制 Ang / 高糖诱导 HK-2 细胞 EMT:降低 HK-2 细胞迁移能力 , 增加 E-Cadherin 蛋白表达 , 减少 -SMA,CollageI,Vimentin,Fibronectin蛋白表达。（三）奈比洛尔和 DPI 均可降低 Ang/ 高糖

7、诱导的 HK-2 细胞内 ROS生成。奈比洛尔减少 Ang诱导的 HK-2细胞 NOX2,NOX4,p22^phox,TGF- ₁,p-ERK1/2 表达及 p-ERK1/2/ERK1/2, 但对 ERK1/2 表达无显著影响。另一方面 , 奈比洛尔增加高糖刺激下 HK-2 细胞 AMPK和 p-AMPK蛋白表达和p-AMPK/AMPK,降低 NOX4,p22^phox,TGF-₁,ERK1/2,p-ERK1/2 表达及 p-ERK1/2/ERK1/2。（四） TGF-₁（10 ng/mL,48h ）可诱导 HK-2 细胞 EMT。此作用可被奈比洛尔和DPI 显著抑制 : 降低细胞迁移能力 , 增加 HK-2 细胞 E-Cadherin蛋白表达 ,