标书王光斌1106141

1、编号：泸州医学院科研项目申报书项目类别A研究生基金项目B普通项目项目名称：人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究项目负责人：王光斌（1106141）起止时间：2013年1月2014年7月所在科室：四川省人民医院皮肤科所属学科：皮肤病与性病学填报日期：2011年11月四川省人民医院2011年11月制1填 表 说 明一、“研究生基金项目”资助在读研究生，根据自己的专业特长和科研学术优势申报课题；“普通项目”面向医院科技人员，择优资助临床医药卫生研究项目。二、申请书填写内容务必真实、可行，表达要明确且简明扼要。三、封面“项目类别”只能选填一种，在该项目类别中画“”。四

2、、“学科分类”是指申报课题涉及到的二级学科，可选填1-2个。五、申请书填写要求用A4纸打印，一式两份。六、有未尽事宜，可另附材料说明。简 表研究项目名称人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究项目类型A临床研究 B应用研究 C对比研究 学科分类皮肤病与性病学经费总预算（万元）8000元申请经费（万元）8000元申请者姓名王光斌性别男出生日期1987-03-19学历硕士学位硕士专业技术职务学生主要研究领域结缔组织皮肤病联系电-mail项目组成员高级中级初级辅助项目摘要项目研究内容和意义简介（限400字）：目的：扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（

3、desmoglein4，Dsg4）胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列，为寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris ，PV）发病机制的研究提供依据。方法：根据GenBank中的Dsg4序列（登录号为AY177664）分析，通过逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法从人正常皮肤组织中抽提RNA，逆转录合成cDNA，聚合酶链反应（PCR）扩增皮肤组织桥粒芯糖蛋白4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4目的基因；应用基因重组技术将目的基因分别与质粒pET32a在T4DNA连接酶作用下相连接，转化Ecoli DH5感受态细菌，用含氨苄青霉素的LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子DNA

4、序列测定鉴定；重组融合蛋白经ELISA法与PV患者、正常对照组血清进行反应。结果：RTPCR扩增产物经凝胶电泳得到均约为350bp的4条条带；质粒载体pET32a连接的目的基因经序列测定后与在GenBank登录的Dsg4胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4核酸序列完全一致，4个Dsg4胞外区域cDNA读码框架正确：Dsg4EC1、EC2、EC3和EC4与患者血清反应，而不与正常对照组血清反应。意义：Dsg4胞外区域多肽片断在PV发病中可能有作用。关键字（最多5个） 桥粒芯糖蛋白4；天疱疮；克隆；融合蛋白；免疫识别课题名称：人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4片段的克隆和在寻常型天疱疮中免疫识别的初步研究

5、一、立项依据和研究内容1、项目的立项依据（注：主要的参考文献）：项目涉及科学领域：皮肤病学，分子生物学，临床生化检验，免疫学，统计分析。寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris，PV)是一类于患者体内产生针对自身表皮角质形成细胞的特异性抗体IgG，并与角质形成细胞结合致细胞间粘附能力丧失，产生棘突松解为特征的自身免疫性大疱性皮肤和粘膜疾病；死亡率目前约5% 15% 。尽管已公认桥粒芯糖蛋白一1(desmoglein 1，Dsg1)和桥粒芯糖蛋白3(desmoglein 3，Dsg3)及其自身抗体与天疱疮发病相关，基因学上也证实了Dsg1和Dsg3二者粘附作用的补偿理论，但临床上仍有一

6、些难以解释的现象，譬如：头面部并非受压或摩擦部位，为何亦系寻常型天疱疮的好发部位甚或更为严重?新近有研究证明了人体组织桥粒芯糖蛋白一4(desmoglein 4，Dsg4)的存在证实了Dsg4是毛囊角化细胞间粘附的重要介质，并发现其为寻常型天疱疮自身抗体的靶抗原。为此，笔者根据GenBank中人Dsg4的cDNA 序列资料，设计特异性引物，应用RTPCR法和重组技术克隆了Dsg4具有抗原性的胞外区域EC1、EC2、EC3 、EC4 多肽片段，并分别与PV患者、正常对照组血清进行反应，为进一步探讨寻常型天疱疮的发病机制研究打下基础。2主要参考文献：1 Bystryn ， Steinmain NM

7、 The adjuvant therapy ofpemphigusArch Dermato，1996；132(2)：2o3-2122 Ken IshiiGreater diversity of desmosomal cadherinsJ InvestDermatol，2003；120(4)：ixxReview3 Ana Kljuic。Hisham Bazzi，John PS，et a1Desmoglein 4 in hairfoIlicle differentiation and epidermal adhesion： evidence frominherited hypotrichosis

8、and acquired pemphigus vulguris Cell，2003；113(2)：2492604 Neil VW ， Christapher Bower Genetic evidence for a novelhuman desmosomal cadherin，desmoglein 4J Invest Dermatol，2003；120(4)：5235305 J萨姆布鲁克，EF费里奇，T曼尼蒂斯著金冬雁，黎孟枫等译分子克隆实验指南第2版北京：科学出版社，1995：6836846 冯云，黄宁，吴琦等卡介苗诱导人肺腺上皮细胞hBD一1 mRNA 的增强表达华西医科大学学报，2000

9、；31(3)：2852887 Takeichi M Cadherins： a molecular family important inselective cellcell adhesionAnnu Rev Biochem， 1 990；59：2372528 邓安梅，仲人前，陈孙孝等寻常型天疱疮自身抗原Dsg3片段的重组表达和免疫识别解放军医学杂志，2002；27(2)；1311332、项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键问题：研究内容：本实验所采用的质粒、菌株和标本原核表达质粒pET32a和大肠杆菌DH5a(四川省人民医院皮肤科与感染免疫研究室保存)。人皮肤组织来源于我科门诊色素痣切除术所

10、带病变周围正常活体组织(1例)。正常人血清采自健康自愿者(3例)，PV患者血清取自我科病房住院患者(3例)。主要试剂及工具酶RNA 提取试剂盒为GIBCoBRL公司产品。两步法RTPCR试剂盒、DNA 分子量标准物、琼脂糖、丁4 DNA 连接酶为TaKaRa公司产品。PCR 产物纯化试剂盒等为OMEGA 公司产品。异丙基一fD一硫代半乳糖苷(IPTG)、Tris碱、丙烯酰(acrylamide)、双丙烯酰胺(bisacrylamide)、甘氨酸为Sigma公司产品 考马斯亮兰R一250、中分子质量蛋白质Marker为上海试剂厂进口分装产品。BCA Protein Assay Kit试剂盒购自P

11、ierce公司。辣根酶过氧化物酶(HRP)标记兔抗人IgG(H+L)为北京中山生物公司产品。其余为国产分析纯。 研究目标：扩增人皮肤组织桥粒芯糖蛋白4（desmoglein4，Dsg4）胞外区域EC1、EC2、EC3和EC4的核酸序列，为寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris ，PV）发病机制的研究提供依据。 拟解决的关键问题：提取RNA并对其进行样品鉴定，引物的设计，逆转录反应，采用荧光PCR反应。3、拟采取的研究方案和可行性分析：研究方案：实验室研究为主研究对象：本实验所采用的质粒、菌株和标本原核表达质粒pET32a和大肠杆菌DH5a及人皮肤组织。研究方法： 1 引物设计 根据

12、GenBank中发表的Dsg4序列(登录号为AY177664)，了解目的基因EC 、EC 、EC。、EC cDNA顺序及限制性内切酶位点，根据引物设计原则在Primer Premier 50软件包辅助下设计了覆盖EC 、EC 、EC。、EC 基因的4对特异性寡核甘酸引物。引物1和引物2分别为Dsg4胞外区域EC。的5 端和3 端(238561)的引物；引物3和引物4分别为ECz的5 端和3 (562896)的引物；引物5和引物6分别为EC。的5 端和3 端(897 1245)的引物；引物7和引物8分别为EC的5 端和3 端(12461575)的引物。引物对分别用BamH I和Hind双酶切。2

13、RNA模板的制备取色素痣皮肤活检术后所余正常组织，无菌PBS清洗标本后用RNA提取试剂盒抽提总RNA，具体步骤参见产品说明书。3 目的基因的扩增 将制备的RNA模板与2L l0×RT 缓冲液、dNTP混合物20 tLL(各种dNTP 为10 mmolL)、OligodT 引物1 I (10tmolI )、反转录酶1 L(100 UtLL)、MgC12 4 I(25 mmolL)、RNA酶抑制剂05 p1 (40 UtLL)混合，于37孵育60 min。PCR反应体系：在冰浴中按以下次序将各成分加入一无菌05 mI 离心管中：10×PCR buffer 5 IdNTP mix

14、 4 L(2 mmolL)、引物2 tLL(10 pmolI )、Taq酶1 L(2 UtLL)、cDNA模板5 L；加ddH O 至50 L。将上述混合液稍加离心，进行扩增，条件为：在93预变性5min，进人循环扩增阶段：93 40 s一58 30 S一72 60 S，循环3O次，最后在72 保温7 min。4 PCR产物纯化 取5 td 扩增产物经溴化乙锭琼脂糖电泳，根据电泳位置估计PCR产物，纯化试剂盒回收预期大小的PCR产物，并在DNA成像系统照相打印结果。5 重组DNA分子的构建以pET32a质粒为原核表达载体，将经过纯化的PCR扩增产物与载体分别用相应的限制性内切酶(BamH I和

15、Hind)进行双酶切，电泳回收双酶切的目的片段，在T4DNA连接酶作用下，与载体pET32a相连接。用CaC1 转化法将连接产物转导人Ecoli DH5a感受态细菌，尔后将其平铺在加有氨苄青霉素的I B培养皿上，37培养。6 重组DNA分子的筛选和鉴定 经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养过夜后，挑选LB固体培养皿上生长良好的细菌克隆(边缘光滑、平整、饱满)接种于3 mL LB液体培养基中，37振荡过夜，挑取菌落摇菌，采用Omega公司小量质粒提取试剂盒提取重组原核表达质粒。用PCR的方法筛选出阳性克隆，并送上海基康生物技术有限公司测序。7 重组DNA 分子的序列分析 通过GanBank

16、中的BI AST程咩对克隆片段的核酸序列及其编码氨基酸序列进行对比分析8 重组融合Dsg4蛋白片段表达产物的提取将4个重组质粒转化大肠杆菌BI 21，将含重组质粒的细菌接种于I B培养基中摇菌过夜扩增，次晨重新接种到5 n1】 IB培养基巾3()(振荡培养211后加人异丙基半乳糖苷(IPTG，终浓度为1 mmol1)，诱导融合蛋白的表达30 继续摇菌6 h 8000 F：rain离心收集细菌，用PBS洗涤2伙，重悬于2 n1【JPBS中，超声破碎细菌，释放出融台蛋白1 5 000 1"rain离心i0 min，收集上清液置于离心管中 用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，并将诱导产生

17、的4种融合蛋白行SDS聚雨烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳9 EI ISA 法捡l刹PV 患者血清与重组Dsg4蛋白片段免疫识剐 PV 患者和正常人血清分别与重组Dsg4蛋白片段免疫识别使用常规引 ISA 疗法检测：包被l0 g提取的重组Dsg4蛋白片段大肠杆菌表达蛋白加入稀释的PV 患者和正常人血清辣根过氧物酶标兔抗人lgG(H+I )抗体使用效价1：1O00加底物DAB显色，终止反直后于酶标仪400 nn1处测定吸光度(A)值，复3孔实验。以Ec1i总蛋白和空载体作为阴性对照21 RT一1 CR 扩增RTPCR扩增产物分别经l0 gl，琼脂糖电泳检测得到4条均约为350 bI)的条带，分别

18、与Dsg胞外区域EC 、EC 、EC。、EC基因的cDNA 列大小相符台【图1)22 Dsg4胞外区域编码基因大肠杆菌表达载体的构建及序列测定将Dsg,1胞外区域EC 、EC 、EC 、EC。基因的eDNA序列RTPCR产物用 H 1和lfi*td酶切后与BamH l和Hind酶切后脱磷酸化的原核表达载体pET 32a连接，获得4个重组质粒 4个重组质粒经PCR 鉴定、序列fj!lJ定结粜表明与GenBank登录的目的基因的cDNA序列相许23 重组表达的4种融合蛋白SDS、JAGE电泳结果诱导的蛋白提取物分别用120 g SDSPAGE分析，结果显示大部分融合蛋白为可溶组分(图2)，4种融合

19、蛋白的相对分子质量均约为32×1024 重组Dsg4 EC、EC：、EC EC 蹑白片段免疫识别PV患者和正常人血清分别与重组)slz,1 EC 、EC 、EC 、EC蛋白片段进行免疫反应的结果见附表经配对，检验，PV 患者血清与重组DsgEC 、EC 、EC 、EC 蛋自片段免疫反应较之于正常人血清、Ecoli总蛋白和空载体差异有统计学意义(P<005)。PV患者中重组Dsg4 EC1、ECz、EC3、EC4蛋白片段两两之间随机区组设计方差分析比较，片段EC 和EC 间差异有统计学意义(P<005)。4、本项目特色及创新之处：本研究的最终目的是克隆出PV 自身抗原Dsg4的胞外区域EC1 、EC2，EC3 、EC4的基因片段，证明其抗原性，可以进一步分析其抗原表位及致病性。Dsg4胞外域的抗原决定簇可被PV患者血清中的病理性自身抗体识别，本研究证实了Dsg4胞外域不同片段均具有抗原性，能被PV 患者产生的自身抗体识别，为进一步纯化4个融合蛋白后用以分析PV Dsg4抗原表位及致病性，并与已知的Dsgl和Dsg3比较研究 打下了基础。具有广阔应用