BrukerInVivoXtreme小动物活体成像系统标准操作规程

1、BrukerIn-VivoXtreme小动物活体成像系统标准操作规程【目的】通过制定本操作规程,规范小动物活体成像系统使用。【准备】1、 实验试剂（药物、染料、麻醉剂、水、脱毛膏等）;2、 实验对象（小鼠、大鼠、黑鼠、裸鼠等）;3、 如需要气体麻醉则要进行氧气准备,将麻醉剂倒入麻醉机中,并检查麻醉机检查窗中液位位于“min”与“Max”之间;气体麻醉前根据室内温度情况酌情打开动物空气加热器。【开机】主机部分:1、打开X-Ra戊源，将开关钥匙打到“ON”的位置；2、打开主机，将主机右后方的电源开关打到“ON”的位置。接着打开电脑，等待网线图标出现一个黄色三角叹号后,将MI软件打开。注意:仪器开机

2、以后,需要大约20分钟的预冷时间。附属部分:1、 如需要进行气体麻醉,则需要打开麻醉机,并对实验对象进行预麻醉;2、如果需要进行三维旋转拍摄，则需准备动物旋转系统（MARS）动物旋转系统的准备需要在不开拍摄软件与MARS控制器按钮打到manual的情况下，先按要求将旋转器安装到暗箱中，然后将按钮打到auto,完成之后即可打开MI软件【拍照】1、将实验对象摆放到托盘中,拍照部位朝下,如拍摄腹部影像,需将实验对象腹部朝下,并将四肢伸展开,然后将托盘放入暗箱拍摄位置,放置就是托盘缺口朝右侧摆放;2、双击桌面MI图标，打开MI软件，单击“Capture”按钮，打开拍摄参数设置界面；1）:拍摄界面顶部显

3、示仪器型号。MI软件提供同时拍摄两张图像的功能,即第一张图像就是Foreground,主图像，第二张图像就是Background背景图像。点击Foreground与Background按钮进行切换，对两张图像的拍摄程序分别进行编辑。2）:左边第一部分File里可以执行与创建、编辑修改一个Protocol,同时,Protocol还可以通过点击软件顶部的工具栏中Protocol按钮打开。3）:第二部分就是选择拍摄模式,共有5种,分别为Fluorescence荧光,Luminescence学发光，Radioisotopix同位素,X-RayXtReflectance反射光,另外可以Custom定制程

4、序。点击Setting的下拉菜单,可以选择我们已经设定好的拍摄程序,或者选择DefaultSession默认设置，与CurrentSession来新建一个拍摄程序。每个拍摄模式都有一个默认设置，具体拍摄条件如下（InVivoXtremeENG,42M）:Tat>le3.TU5lofModaIriesandassccialedOetauits«Uinys.ModalityBackgroundExposureTim#FOV和scopBin*FilterFocalZoneFluorescenceStandardX-ray2secLastselected22x2EmSelectExSe

5、lectTrayLuminescenceStandardX-ray10secLastselected114x4Em-NaneTrayRadioisotopicReflectance30secLastselected114x4Em-NoneX-rayX-RayMore1.2secLastselected21x1X-ray-0.4(45kVp)X-rayReflectanceNone0.1sec(4MP)02sec(16MP)Lastselected111x1NoneTrayH),Forthe16Mpcarnera,thebinningshouldbedoubledForexample2x2bin

6、ningbecomes4x4.右边的save保存程序，saveas另存为与重命名，Delete删除程序。点击Unlock与Lock键，可以对锁定的程序解锁或为锁定的程序设置密码锁定。在Annotation框中输入文字，可以对该程序拍摄的图片进行至多48个字符的注释。在AccumulationPath栏里选择图像的保存路径。4):第三部分就是选择或者不选背景图像,BackgroundImage的下拉菜单里可以不选背景图像或者选择某个拍摄程序生成背景图像。软件预设了一个标准的X光拍摄程序，一个高分辨率的X光拍摄程序与一个反射光的拍摄程序，具体拍摄条件可以在Background中查瞧。如果我们在Ba

7、ckground中编辑保存了自己的程序，在这里也可以选用。5):第四部分中可以查瞧设备的IP地址，相机的序列号与CCD就是否已经准备好，如果方块变成绿色就表示CCD已经降到预设温度，仪器已经可以正常使用。6):右边第一部分就是光源设定，在光源的下拉菜单中，生物发光与同位素拍摄选才?Luminescence反射光拍摄选择ReflectanceRGB,荧光与白光拍摄选择Muti-wavelength,X光拍摄选择X-ray。在ApplyReferenceFile中选择就是否应用校正文件，None就是不应用校正文件,Auto就是当已经设置了合适的校正文件时，软件自动选择匹配的校正文件，选才¥

8、;Manual后先进行正常的图像拍摄，拍完后移除样品与托盘，再进行校正文件的拍摄。为了保证图像质量，凡就是涉及到运用光源的实验，例如荧光，白光,反射光与X光成像，都必须设置合适的校正文件。荧光、白光与反射光的校正文件跟光圈大小、成像视野、焦距与激发发射波长相关；X光的校正文件跟光圈大小、成像视野、焦距与铝膜相关；当改变拍摄程序中的以上参数时，必须重新拍摄与设置校正文件。以下就是校正文件的推荐参数设置：SettheexposuretimeusingtheExposureTimetexteditboxandUnitspop-upmenu./Fluorescencesettheexposuretim

9、eto1secondwith4x4binningandincreaseordecreaseasnecessarytogenerate>10,000graylevelsinasingleexposure.值FNOTE:Longerwavelengthfilterpairsmayrequirelongerexposuretimes./Reflectance-settheIntensityofallLEDstoHighandbeginwitha0,2secondexposureanincreaseasnecessarytogenerate>10.000graylevelsinasingl

10、eexposure,/X*Ray-settheexposuretimeto2secondswith2x2binningtogenerate>10t000graylevels,摩平NOTE:AnX-rayIlluminationReferenceFileiscreatedatthetimethattheIn-VivoXtremeImagingSystemisinstalled.Itisonlynecessarytocreateanewilluminationreferencefileiftheoriginalfileiscorruptedoraccidentallydeleted,吐NOT

11、E:CreationofanX-rayIlluminationReferenceFileshouldbeideallyperformedafterarestartofthesystemafterremainingidleovernight.当选择多重曝光时，应用FinaAccumulation最终只生成一张图片，AllAccumulations每次曝光的最终结果都就是与之前的图片叠加后的结果，保存每次曝光所产生的图片，但在软件中只打开最后一张。AllImage就是指保存每次叠加的图片以及单张图片。SeparateImages就是指只保存单次曝光的结果图片。7）右边的第二部分就是选择滤光片，当进

12、行X光拍摄时，可以选择不同厚度的铝膜，铝膜越厚，过滤掉低能量的X射线就越多，骨骼与肌肉软组织的对比度越高，图像越清晰。因此大鼠X光成像，对骨骼清晰度要求高的图像，或者需要进行骨密度分析的图像，建议选择0、8mm厚度的铝膜。这里可以选择X光机的能量，有20、25、30、35、40、45几档可选，高清晰度的X光成像需要高能量，一般大鼠或小鼠的全身骨骼成像选择45KVR在荧光拍摄时需要选择激发与发射滤光片，荧光成像中根据荧光物质的特性来选择相应的滤光片，需要注意的就是激发与发射滤光片之间波长间隔必须至少在50nm以上，否则会带来强烈的背景干扰。白光、反射光、生物发光、同位素与X光成像，滤光片都选择0

13、与0。8）:右边的第三部分就是相机设置。包括ExposureType曝光方式，这里可选Standard标准曝光,TimeLapse间隔曝光与做校正文件时应用的IlluminationReference曝光模式。曝光时间可以以秒与分钟为单位任意选择火光的最小曝光时间就是1、2秒,其它拍摄模式的曝光时间最小就是0、1秒（XtremeFI就是0、2秒）,最长就是10分钟。曝光次数最大可选择32次，但过多的曝光次数就是不合适的，可随机调整。当在曝光方式中选择TimeLapse时，这里可以选择拍摄间隔与在多长时间或者几帧以后拍摄停止。Mode（选才?CCD在采集图像时的读取速度）里有HighSpeed与

14、HighSensitivity两个选项，建议荧光、反射光与X光选择HighSpeed化学发光与同位素选择HighSensitivityPredictExposureTime就是预测日M光按钮，用此按钮可以估计生物发光与同位素的曝光时间。选中以后弹出对话框,输入曝光所需的灰度级,点击计算按钮,Xtreme会自动计算所需要的最佳曝光时间。Binning就是指像素合并，XtremeBI最高到32x32,XtremeFI最高到64x64,像素合并就是指将CCD的相邻几个像素合并成一个像素在图像中呈现,提高CCD的拍摄灵敏度与响应速度。当拍摄弱信号比如化学发光或者同位素时,可能需要用到4x4以上的像素合

15、并。InstantDCR就是指CCD的即时暗电荷修正设置，对大多数的图像来说，0、5-1之间的值比较合适。当用到小样品台进行小视野的X光成像时，必须勾上MagStage这个选项，小样品台提供放大倍数为3、3倍的X光成像,特别适合拍摄爪子、关节、头颅等部位。FOV中调节成像面积,XtremeBI分别有7、2x7、2cm,10x10cm,12x12cm,15x15cm,18x18cmf19x19cm的6个成像视野可选择。fStop就是选择光圈的大小，光圈数值越小通光量越大，成像的信号强度越高。FocalPlane就是选择成像的焦距，荧光、白光与反射光等所有在托盘上的成像选择Tray,X光与同位素等

16、在磷屏上的成像选择X-Ray9):右边的最下方可以切换拍摄界面的Standard与Advanced模式。Preferences按钮可对仪器硬件进行设置与调试。点击Preview进入预览界面，预览界面中可以调节拍摄时间与焦距，打开反射与白光光源等。点击Capture按钮直接进行拍摄。3、新建不同模式的拍摄程序1):以新建一个荧光拍摄程序为例,首先在Modality中选择Fluorescence,Setting中选择CurrentSesion,ApplyRefernceFil升选择None,然后设置合适的激发与发射滤光片，这里以绿色荧光蛋白GFP的激发与发射光480,535为例,ExposureT

17、ype选择Standard,曝光时间、Bin、FOVfStop与FocalPlanet艮据需要选择，下面就是不同拍摄模式的推荐拍摄程序:Thefollowingtableisasummaryoftheseguidelinesandhelpfulsuggestions:Table4.1：imageCaptureGuidelinesModalityExposureType"f-stopIlluminationTypicalExposureTimeFluorescenceStandardexposure,binningM.1-氏6Multi-wavelength1-30secondsLum

18、inescenceStandardexposurerbinningf1.1None<5minutesRadioisotopicStandardexposure,binningf1.1None<5minutesX-RayStandardexposurehupto2x2binning2-M.OX-Ray1.2second-iminuteReflectanceStandardexposurenobinningRGB-LED0Jsecond(4MP)0.2seconds(16MP)*StandardSingleexposuresprovideexcellentquality16-bitim

19、agesthataregoodformostapplicationsStandardmultipteaccurriulartedimageoptionsmayalsobeusedtoimprovequanUtstionanddvnarriicranae-bevond16-bit.选好之后点击Saveas为程序命名并保存程序。由于荧光、白光、反射光与X光需要做背景校正，所以接下来我们做一个背景校正文件，在ExposureType中选择IlluminationReference,把动物仓中的样品与样品托盘取出，正确放置EPI屏（做X光背景校正文件需正确安装X光磷屏，做反射光校正文件需放置Backd

20、rop屏）,关闭仓门点击Capture按钮，软件进行校正文件的拍摄。拍完之后校正文件自动在MI软件中打开，此时将拍摄模式改回Standard校正文件应用中选择Auto,点击Save保存程序，这样一个完整的荧光拍摄程序就建好了。2）:设置Background在拍摄界面上方点击Background按钮切换到背景图像编辑界面。与Foreground的设置相似，Background也可以选择荧光、生物发光、同位素、X光与反射光的拍摄模式，具体程序的设置请参考Foreground的设置，需要注意的就是，软件设置了2个X光与一个反射光的默认程序供用户选择，用户可根据具体需求设置。当一个设置了Background的程序点击Capture拍摄时，软件会要求提供保存路径，拍完之后两张图像直接存储且在MI软件中打开,Background叠力口Foreground后显示,Fore