细胞培养工作流程

1、细胞培养工作流程一、 Vero细胞复苏流程1、 准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉

2、素、7.5%NaHCO3溶液。1.5复苏用水准备：（1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1含0.1%新洁尔灭溶液。（2）百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1含0.1%新洁尔灭溶液。 1.6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。1.7溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。2、 配液配方复苏液MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液100/300/新生牛血清109%10%154.5%5.5

3、%3%谷氨酰胺溶液10.9%1%30.9%1%庆大霉素0.10.12%0.13%0.4 0.12%0.13%7.5%NaHCO31.51.5%1.8%4.51.5%2%辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.30.4 ml/cm

4、2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。3、 种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。4、 种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知细胞区人员将种子从传递

5、窗取走。迅速传递并浸入百级内36.5±1含0.1%新洁尔灭溶液中，百级内操作人员取出擦干。5、 移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。6、 培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。24小时内（细胞贴壁80%）进行换液。7、 清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间， 层流罩内用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。8、 复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。9、换液换液前准备与复苏前相同。观察培

6、养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.30.4 ml/cm2）。拧紧瓶口，平放到恒温室培养。最后按规定清场二、 细胞传代流程1、 准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认

7、无不相关物品。1.2设施检查：确认空调、蠕动泵工作状态完好。1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。并运行30分钟后开始生产操作。1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液（含0.25%的胰蛋白酶溶液）。2、 传

8、代1操作2.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液400/新生牛血清204.5%5.5%3%谷氨酰胺溶液40.9%1%庆大霉素0.5 0.12%0.13%7.5%NaHCO381.8%2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。2.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：30ml/ T

9、75 cm2瓶。（加量：0.20.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。2.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.020.04 ml /cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5恒温或室温继

10、续作用510分钟。注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。2.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养瓶打开，用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。2.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。2.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的

11、培养瓶放置恒温室静置培养。2.7清场按规定清场2.8观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作3.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液600/新生牛血清304.5%5.5%3%谷氨酰胺溶液60.9%1%庆大霉素0.75 0.12%0.13%7.5%NaHCO3121.8%2%向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。3.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开，将上

12、清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。（加量：0.20.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。3.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.020.04 ml /cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养

13、瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5恒温或室温继续作用510分钟。注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。3.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。3.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。

14、3.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。3.7清场按规定清场3.8观察每天观察细胞生长状态4、 传代3操作4.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液2000/新生牛血清1004.5%5.5%3%谷氨酰胺溶液200.9%1%庆大霉素2.5 0.12%0.13%7.5%NaHCO3401.8%2%辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员

15、需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。注意事项：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位（除吸管后端的任何位置），如不慎碰到应立即废弃。安装管道过程中，如管道不慎碰到其他部位应立即废弃。4.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。（加量：0.20.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员

16、盖紧塞子，标记用量、日期。操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。4.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.020.04 ml /cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5恒温或室温继续作用510分钟。注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成

17、后马上盖好盖子。室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。4.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。然后将8个培养瓶的细胞合并到1个T175 cm2瓶中。用传液管道吸入MEM中，混匀待用。注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。4.5分种辅助人员将10层细胞工厂盖子打开，操作人员将连接管道出液口处的细胞工厂转接头无菌取出后与细胞工厂左端口对接，并将细胞工厂横放在操作台上，同时将细胞工厂右端的盖

18、拧松。辅助人员真空泵打气端与管道空气滤器相连，开启真空泵将生长液打入细胞工厂内。结束后，操作人员用止血钳将管道夹紧后将细胞工厂右端的盖拧紧，平衡后把细胞工厂向上直立，再取下左端的连接细胞工厂管道的转接头交辅助人员，用盖子盖紧右侧的细胞工厂接口，将细胞工厂放平。然后将管道内残夜打入准备好的T25 cm2培养瓶中作对照。注意事项：注意打气过程中管道不要崩开。4.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒温室静置培养。4.7清场4.8观察5、传代4操作5.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液8000/新生牛血清4004.5%5.

19、5%3%谷氨酰胺溶液800.9%1%庆大霉素10 0.12%0.13%7.5%NaHCO31601.8%2%辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。注意事项：操作人员取管道时连接MEM液桶内管道不能碰到包装纸外部，将管道放入MEM液桶内时，伸入桶内管

20、道不能碰到MEM液桶外部，否则此管道停止使用。5.2洗涤辅助人员将PBS打开，用火焰消毒瓶口，放到盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂内上清倒入废液桶，然后将细胞工厂平放在桌面上，倒入PBS，加入量：1L/CF10（0.20.4 ml/cm2），盖上盖子，平衡PBS液后放平，前后左右摇晃几次，倒掉。注意事项：千万不能污染细胞工厂瓶口5.3消化辅助人员打开消化液瓶口，用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.020.04 ml/cm2) 。平衡后放平，摇晃细胞工厂，使消化液铺满整个细胞面，带细胞间质疏松后倒掉，盖好盖子放到恒温室5

21、-10分钟。注意事项:室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。5.4悬液制备当细胞开始脱落时，将细胞工厂竖立在台面上，把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞工厂相连，拧松右侧盖子，放到细胞工厂，开启真空泵，打入1L生长液停止。盖好盖子，辅助人员双手握住细胞工厂，上下小幅度快速震荡，使细胞充分分散。然后连接生长液，将细胞悬液打入生长液桶内，混匀待用。注意事项：摇细胞工厂时要快速有力度，使细胞充分分散。5.5分种将细胞悬液分4份均匀打入4个10层细胞工厂，并将残液打入培养瓶中作对照。5.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒温室

22、静置培养。5.7清场5.8观察6、传代5操作 6.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液32000/新生牛血清16004.5%5.5%3%谷氨酰胺溶液3200.9%1%庆大霉素40 0.12%0.13%7.5%NaHCO36401.8%2%辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。PBS、消化液管道均按此方法安装。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将

23、溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。注意事项：操作人员取管道时连接桶内管道不能碰到包装纸外部，将管道放入桶内时，伸入桶内管道不能碰到桶外部，否则此管道停止使用。6.2洗涤辅助人员将细胞工厂上清倒入废液桶，交由操作人员与PBS管道相连，用真空泵打入1L PBS溶液，盖好盖子，摇晃几次后倒掉。注意事项：千万不能污染细胞工厂瓶口6.3消化辅助人员打开消化液瓶口，用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂平放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10(0.020.04 ml/cm2) 。平衡后放平，摇晃细胞工厂，使消化液铺满整个

24、细胞面，带细胞间质疏松后倒掉，盖好盖子放到恒温室5-10分钟。注意事项:室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉消化液，避免细胞脱落。6.4悬液制备当细胞开始脱落时，将细胞工厂竖立在台面上，把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞工厂相连，拧松右侧盖子，放到细胞工厂，开启真空泵，打入1L生长液停止。盖好盖子，辅助人员双手握住细胞工厂，上下小幅度快速震荡，使细胞充分分散。然后连接生长液，将细胞悬液打入生长液桶内，混匀待用。注意事项：摇细胞工厂时要快速有力度，使细胞充分分散。5.5分种将细胞悬液打入4个10层细胞工厂和3个40层细胞工厂，并将残液打入培养瓶中作对照。5.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒温室静置培养。5.7清场5.8观察7、 传代6操作7.1配液配方MEM生长液名称加入量（ml）含量控制范围MEM培养基溶液96000/新生牛血清48004.5%5.5%3%谷氨酰胺溶液9600.9%1%庆大霉素1