现代生物技术与新药研究 第十讲 免疫调节剂与核酸药物的筛选研究策略

1、第十讲 免疫调节剂与核酸药物的筛选研究策略胡海峰主要内容n免疫调节剂定义 免疫抑制剂免疫增强剂n核酸药物定义作用机理品种实例介绍人体免疫及其功能n免疫，又称是免疫性或免疫力，是指机体在识别自我的基础上，辨别、消灭和排除抗原性异物以维护机体的稳定性和生理平衡的过程。n对人体主要有以下三大功能1、 防疫功能：免疫能帮助机体消灭与消除入侵之“敌”病原微生物及其抗原。2、 稳定功能：免疫能帮助机体消除新陈代谢中损伤与衰老死亡的细胞，维持机体内部的“治安”。3、 监控功能：免疫能帮助机体抑制和消灭癌细胞持续性感染。如有的人患病症没用药而自然痊愈，即是免疫的作用。免疫调节（Immunoregulation

2、）n免疫调节免疫调节主要是指在免疫应答过程中，各种免疫细胞与免疫分子相互促进和抑制，形成正负作用的网络结构，并在基因的控制下，完成免疫系统对抗原的识别和应答。免疫调节（Immunoregulation）n免疫分子的调节作用1 抗体封闭抗原作用（结合抗原表位，阻止识别，抑制体液免疫应答）2 免疫复合物的调节作用 （免疫复合物既可促进免疫应答，又可抑制免疫应答）3 免疫细胞表面调节性受体的作用 【激活受体（正调节），抑制性受体（负调节）】n免疫细胞的调节作用1 T细胞调节2 B细胞调节3 NK细胞与巨噬细胞调节n整体水平的调节作用1 神经和内分泌系统对免疫系统的调节 2 免疫系统对神经系统和内分泌

3、系统的影响T细胞的调节 T T细胞在免疫调节中决定免疫应答的类型，协调细细胞在免疫调节中决定免疫应答的类型，协调细胞免疫和体液免疫之间的关系胞免疫和体液免疫之间的关系。 ThTh细胞的调节细胞的调节 分类：分类：Th0Th0细胞、细胞、Th1Th1细胞和细胞和Th2Th2细胞细胞 Th0Th0细胞为细胞为Th1Th1细胞和细胞和Th2Th2细胞的前体细胞；细胞的前体细胞； Th1Th1细胞辅助细胞免疫应答；细胞辅助细胞免疫应答； Th2Th2细胞辅助体液免疫应答。细胞辅助体液免疫应答。免疫调节剂n对人体免疫系统具有抑制或增强作用的物质称为免疫调节剂n免疫抑制剂: 抑制免疫反应（FK506）n免

4、疫增强剂：增强人体的免疫功能（多糖）免疫抑制剂的研究作用机理筛选策略重要品种免疫抑制剂n免疫抑制剂是指能够抑制免疫反应的药物，它能抑制淋巴细胞增殖、分化和影响淋巴细胞的功能。n选择性免疫抑制剂是指对淋巴细胞有专一性作用，对红细胞生成几乎没有影响，无毒性或毒性极微，不损害宿主对细菌和真菌的感染防御机制。n免疫抑制剂应用于器官移植中的抗排斥作用和治疗自身免疫性疾病如风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、霉菌病、炎性肠病、自身免疫溶血性贫血等。免疫抑制剂作用机理n第1代：以皮质激素、硫唑嘌呤、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)为代表，主要作用为溶解免疫活性细胞，阻断细胞的分化，其特点为非特异性、广泛的免疫抑制。n第

5、2代：以环孢素A(CsA)和FK506为代表，主要阻断免疫活性细胞的白细胞介素2(IL-2)的效应环节，因其以淋巴细胞为主而具有相对特异性。n第3代：以单克隆抗体、雷帕霉素、霉酚酸脂为代表，其作用于抗原呈递和分子间的相互作用，与第2代制剂有协同作用。n第4代：以抗IL-2受体单克隆抗体、FTY20等为代表，主要针对改变cytokine环境，如抑制TH1，增强TH2。作用机理1环孢素和FK-506通过与胞浆内可溶性蛋白质亲免素受体结合而发挥作用的。亲免素受体有3个亚型，分别为Cyclophilin, FKBP-12,Pin1, 它们都具有旋折酶（PPIase，羟脯氨酸顺反异构酶）的活性。其中FK

6、-506与FKBP12结合，形成药物受体复合物，抑制T细胞内钙调素依赖的磷酸酶（Calcineurin）活性，导致T细胞IL-2基因转录受抑制，IL-2分泌减少，造成免疫抑制。作用机理2n霉酚酸酯（MPA）高选择性、非竞争性、可逆性的次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶（IMPDH）抑制剂，可抑制鸟嘌呤核苷酸的经典合成途径。 人体内淋巴细胞与其他细胞不同，不能利用嘌呤补救途径合成嘌呤，因此 MPA可以高度选择性的抑制淋巴细胞活化，抑制机体的细胞免疫和体液免疫功能。同时在淋巴细胞激活过程中，MPA通过减少GTP和GDP岩藻糖、GDP-甘露糖含量抑制淋巴细胞表面粘附分子的糖基化，从而抑制激活的淋巴细胞与上皮细胞

7、或靶细胞粘附而杀伤靶细胞。TCR:T cell receptor作用机理免疫抑制剂筛选n传统的筛选方法MLR混合淋巴细胞反应T细胞抑制活性NK细胞抑制活性n新的筛选方法抑制Calcireurin活性方法（Dibefurin）P56酪氨酸蛋白激酶活性方法（Lymphostin）抑制活化T细胞的核因子的NFAT-68和NFAT-133免疫抑制剂筛选n含RBP基因的酵母筛选模型用含有RBP(雷帕霉素结合蛋白，Rapamycin Binding Protein, RBP)基因的啤酒酵母菌RS188N及其变株RS188N rbp：LEU(RBP基因片段由于被亮氨酸基因嵌入从而阻断该基因编码RBP的产生)

8、的筛选模型，凡对RS188N抑菌圈比对RS188N rbP ：LEU的抑菌圈大6mm以上，被认为产生Rapamycin及其结构类似物。抑制Calcireurin活性方法nAbbott公司建立了Calcineurin活性分析体系:将小牛Calcineurin和Calmodlin在反应缓冲液中混合,以4-甲基伞形基磷酸为底物。加入含底物的缓冲液以起始反应,快速振摇混匀反应体系,37培养1小时,加入碱性缓冲液以终止反应。在355nm激发光下测460nm荧光强度。利用这一筛选体系发现了真菌产物Dibefurin,其抑制Calcineurin活性的IC50为g/ml;抑制MLR的IC50为2.5g/ml

9、(BrillG M,1996年)。重要品种In 1970 ， cyclosporins were isolated in the Sandoz Laboratories in Basel from Cylindrocarpon lucidum Booth (a fungus from a Wisconsin soil sample) and olypocladium inflatum Gams (a fungus from a Norwegian soil sample). Their structures were reported in 1976. 1 It was fortunate t

10、hat this group tested all of their new compounds for not only antibacterial and antifungal activity, but also for antiviral, cytostatic and immunosuppressiveactivity. The latter tests looked for a diminution of cytotoxic T-cell activity, and cyclosporin A proved to have high potency coupled with a l

11、ack of cytotoxicity and this was a key discovery.环孢菌素A重要品种n Subsequently, the structurally unrelated polyketide metabolite FK506 (3) was isolated in 1984 by the Fujisawa Pharmaceutical Company who were engaged in a systematic screening programme for agents with similar activity to cyclosporinnStrept

12、omyces tsukubaensis 9996 (found in a soil sample from the Tsukuba region of N. Japan) provided a product with around 100 times greater immunosuppressant activity than cyclosporin A. Its structure was finally elucidatedin 1987 and it subsequently entered clinical use in 1991 under the trade name Tacr

13、olimus (Prograf).来氟米特（LEF）又称雷抑素免疫增强剂的研究n免疫增强剂根据其作用原理可分为中枢性免疫增强剂和储存性免疫增强剂；n储存性免疫增强剂与抗原同时、同部位注射时可以改变抗原分子构型或其电荷，从而增强抗原性，或延长抗原的储存和释放的时间，由此持续地刺激机体而增强特异性免疫应答；n中枢性免疫增强剂能激活一种或多种免疫活性细胞或是通过促进免疫细胞表面标志的表达、加速细胞的成熟与增殖，或是作用于某些淋巴细胞的亚群而间接发挥作用；n常用的免疫增强剂有铝佐剂、油悬液佐剂、BCG、干扰素、脂多糖、真菌糖肽、某些中草药等。白细胞介素-2n白细胞介素-2是辅助T细胞分泌的淋巴因子，在

14、免疫系统中起着重要的作用，它能促进T细胞，NK细胞，B细胞的分化成熟及激活其生物活性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞活性，还能促进许多淋巴因子如干扰素、肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体生成。因此白细胞介素-2能大大增强机体免疫功能，对不少感染性疾病有治疗作用，对某些肿瘤的防治有良好的效果。真菌多糖n 从各种真菌中提取的真菌多糖组分，常有活化人体巨噬细胞，刺激抗体产生，从而达到提高人体免疫力，增强人体抗病防癌能力的作用。从真菌中提取的多糖，优于从动物体内血液中提取的免疫球蛋白，具有更大的提高人体免疫力和抗癌的作用。n香菇多糖：为一种免疫刺激剂，能增强辅助T细胞的功能，可用于治疗慢性肝炎和肝癌；n银

15、耳多糖：能明显促进特异抗体的形成和腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增加外周血液中T淋巴细胞数量；n冬虫夏草多糖、灵芝多糖等。免疫增强剂发展趋势n未来的免疫增强剂应该有以下特征：能促进体液免疫和细胞免疫；能增强弱免疫性抗原的抗原性，而没有毒副作用；能以不同途经免疫，也能用于不同抗原；能在免疫抑制个体中发挥作用；能应用于食用动物不应有残余毒素；能有效影响免疫反应的质量；稳定、便宜而且容易生产和保存。核酸药物的研究n什么是核酸药物？各种具有不同功能的核酸、核酸类似物、寡聚核糖核苷酸（RNA）和寡聚脱氧核糖核苷酸（DNA），后者主要作用于基因水平，在信息流上游起作用。n核酸类药物：Aptamers， 抗基因核

16、酸药物，核酶，反义核酸和其他核酸类似物等。核酸药物分类反义核酸n反义核酸包括反义()和反义()两种,是指与靶(多为)具有互补序列的或分子。n它通过与靶进行碱基配对结合的方式参与基因表达的调控。通常把转录产生反义的基因称为反义基因()或反义,因其与转录靶的目的基因是反义的。 新的反义核酸药物新的反义核酸药物n反义核酸的第二代新药通过抑制apoB蛋白100来降低血脂，它是致动脉硬化脂蛋白的克星；n波士顿麻萨诸塞州召开的2004年世界药物开发技术的会议上，美国旧金山加利福尼亚大学的Stephen Young说：“因为这种药物专门抑制apoB蛋白，从而达到降低血浆胆固醇的作用，这在人类历史上还是第一次

17、，所以原始资料另人非常满意。抑制SARS病毒复制的反义核酸药物 n工研院生物醫學工程中心與美國ISIS藥廠於1月14日同步在台北及美國加州同步發表SARS反意核酸藥物n其一為開發可有效抑制SARS冠狀病毒複製的第二代反意核酸藥物；其二為成功完成利用肺部輔助器械之吸入式噴霧劑型藥物。n以開發RNA藥物為主的美國ISIS公司為全球第一個商業化量產反意核酸藥物的公司，共取得一千餘項反意核酸藥物相關專利，目前至少有11個反意核酸藥物正在临床試驗階段，包括：氣喘、癌症等。RnR是第一个被应用于动物肿瘤和临床白血病治疗的,并取得一定的效果。但由于它在抗肿瘤方面存在一定的缺陷和不足,因此酶学家们转向其它的的

18、研究。最初从曲霉菌中分离出的一种,能够抑制大鼠肿瘤生长,但是临床试验显示其毒性较高,抗肿瘤作用较弱。后来, 显示出强大的抗肿瘤功能,通过细胞毒作用诱导肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤的生长,特别是恶性肿瘤细胞对其敏感性更强。传统的核苷酸药物n传统的核酸药物或称为核苷、核苷酸及其类似物如：8氯腺苷、三氮唑核苷，S腺苷蛋氨酸等S-腺苷蛋氨酸；S-（5-脱氧腺嘌呤核苷-5-基）蛋氨酸微球、纳米球制剂n微球()、纳米球()技术是由上世纪末发展起来的新型给药技术。n微球系指药物溶解或分散在辅料中形成的粒径为1250微小球状实体,而粒径在101000之间的通常称之为纳米球(纳米粒)。n药物以微球、纳米球的形式给药后,可使药物具有靶向和控释作用,改变了药物在体内的动力学,从而提高药物的生物利用度,降低毒副作用。n除了抗肿瘤化疗药物的以微球形式给药外,来自传统中药领域抗癌