沉淀法综述论文

1、盐析法分离纯化生物物质综述摘要：盐析作用被认为是盐夺去了溶解蛋白质的水所引起的。蛋白质疏水部分附近的水分子结合成所谓窗格的规则网状结构，和疏水部分表面形成界面。蛋白质分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。关键词：盐析法;分离纯化;蛋白质;溶解度;离子强度正文：引言沉淀法是最经典的分离和纯化生

2、物物质的方法，目前仍广泛运用在实验和工业中。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法常作为初步分离的一种方法，用于去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。 沉淀法由于其成本低、收率高（不会使蛋白质等大分子物质失活）、浓缩倍数高（可达1050倍）、操作简单等优点，根据有关统计，大约80%的酶浓缩过程采用沉淀方法，其中用硫酸铵沉淀的约60%，有机溶剂乙醇沉淀的约35%。沉淀法制得，平均收率约为87%。沉淀法的优点使其成为生物下游加工过程中运用最广泛的纯化方法1-2。沉淀法分离纯化的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同或热稳定性的差异而达到分

3、离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化； 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化； 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白； 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用； 有机

4、聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。盐析沉淀法1、盐析法1.1 中性盐沉淀（盐析法）的定义 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，2040饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。1.2盐溶、盐析当中性盐加入

5、蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：a、无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；b、中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。41.3盐析法沉淀蛋白质的基本原理盐析作用被认为是盐夺去了溶解蛋白质的水所引起的。蛋白质疏水部分附近的水分子结合成所谓窗格的规则网状结构，和疏水部分表面形成界面。蛋白质分子的COOH、NH2和OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包

6、围于蛋白质分子周围形成1nm100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。41.4离子强度对盐析过程的影响Cohn经验公式式中：S蛋白质溶解度，mol/L；I离子强度 （c:离子浓度；Z：离子化合价）盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks盐析

7、常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。5以Cohn经验公式为基础，可将盐析方法分为两种类型：Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理；而盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。31.5盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。不同盐类对同一蛋白质的不同盐析作用，其Ks值的顺序

8、为：磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁选用盐析用盐的几点考虑：（1）盐析作用要强，即分离效果要好；（2）盐析用盐需有较大的溶解度，最好是低温时也有很高的溶解度；（3）盐析用盐必须是惰性，即不易引起变性，有稳定的与蛋白质结构作用；（4）来源丰富、经济。31.6盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再

9、离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。1.7盐析影响因素1、蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度

10、对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于25 mg/mL30mg/mL。2、离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。3、盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4、pH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用

11、中性盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。5、温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25）比0时溶解度低，更容易盐析。蛋白质沉淀后宜在4放3 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。盐析时，分子量较小的蛋白质逐步沉淀下来可能就值得怀疑。具体的蛋白需要具体的摸索，当然，对肽来说，结论也是一样的。41.8 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下： 取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离

12、样品溶液，冷至05，调至该蛋白质稳定的pH值，分610次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到610个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。2.盐析法与其他沉淀法在细胞提取物的进一步分离纯化的运用区别从细胞中提取出来的生物大分子是不

13、纯净的，必须进一步分离纯化才能获得纯品。在生物大分子制备工作中，分离纯化是比较复杂和重要的一个环节。对于异类的物质，如提纯蛋白质和酶时混杂着核酸，提纯核酸时混杂着蛋白质或多糖，一般可用专一性酶水解、有机溶剂抽提、选择性分部沉淀等方法处理，小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互相转化被分离或最后用透析方法除去。而对同类物质，如酶和杂蛋白，RNA和DNA以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间的分离，情况则复杂得多，主要应用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超速离心法、柱层析法等。其中盐析法、等电点法、结晶法用于蛋白、酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯

14、较多；柱层析法、梯度离心法在蛋白质和核酸的提纯工作中应用均十分广泛。3.总结盐析法由于具有：a、成本低，不需要特别昂贵的设备；b、操作简单、安全；c、不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质的优点，使得盐析法在生物分离纯化中得到广泛的运用。盐析沉淀法不仅是蛋白质初级纯化的常用手段，在某些情况下，盐析沉淀法也可用于蛋白质的高度纯化。对于杂质含量较高的料液，可利用反复盐析沉淀并结合其他沉淀法，制备纯度较高的酶制剂。当然，盐析法也有不足之处，他就是分辨率不够高，利用盐析沉淀初级纯化的产物中盐含量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。除盐的方法有超滤、透析、凝胶过滤，将沉淀重新溶解后再用