大肠埃希菌检查(新)

1、实训一大肠埃希菌的检查一、实训目标1 .熟悉药品中大肠埃希菌的检验原理。2 .掌握由口服药品中分离鉴定大肠埃希菌的程序及步骤。3 .学会分析检验结果，识别大肠埃希菌的特征。4 .掌握检验数据的处理，能够规范书写检验原始记录及检验报告书。二、实训原理大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，故常来源于人和动物的粪便，所以常作为粪便污染的指标。一旦被检药物中查出大肠埃希菌，表明该药品已被粪便污染，可能存在肠道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药物后有引起感染的危险。因此，大肠埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国家药品卫生标准规定口服药品不得检出大肠埃希菌。中国药典采用了MUG-Indole快速测定药品中大肠埃希菌。

2、在MUG式验中,将MUG4-甲基伞形酮葡糖甘酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基中，被大肠埃希菌的B-葡萄糖醛酸酶直接分解产物又作为一种指示系统，在366nm紫外光下呈现兰白色荧光，即MUG日性；若无荧光，即MUGI性。靛基质（Indole）试验中，大肠埃希菌能分解蛋白陈中的色氨酸，生成呷咪。呷咪的存在可用显色反应表现出来。呷咪与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰呷深，为红色化合物。因此根据大肠埃希菌的这一性质，对MUGg阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛试剂数滴，轻摇试管，培养液上层呈现玫瑰红色者（阳性），报告检出大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳，需要进一步的培养和生化

3、试验检查。本方法对大肠埃希菌的检出率达98%。培养温度：控制菌培养温度为3035Co三、实训步骤（一）实训用设备、仪器与试药的准备100ml量筒、10ml吸量管、500ml烧杯、250ml锥形瓶、150ml锥形瓶、玻棒、大试管、6cm培养皿、吸耳球、小试管、1ml吸量管乳糖胆盐培养基、MUG9养基、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、蛋白陈、1.0mol/lHCl溶液、1.0mol/lNaOH溶液、EMB对二甲氨基苯甲醛、戊醇、盐酸稀释液与培养基的配制1）PH7.0氯化钠-蛋白陈缓冲液（200ml/2组）磷酸二氢钾0.7g磷酸氢二钠1.5g氯化钠0.9g蛋白陈0.2g蒸储水200ml配制：取上述成

4、分混合，溶解，分装锥形瓶2个（用150ml锥形瓶），约90ml/个，包扎，标记，121,15min灭菌。乳糖胆盐培养基（400ml/2组）2）乳糖胆盐培养基12g蒸储水400mlPH=7.6配制：称取，溶解，调节PH值，分装锥形瓶4个（用250ml锥形瓶），约100ml/个，包扎，标记，115,15min灭菌（二）实验用仪器的包扎（以组为单位）1ml吸量管2支、50ml烧杯1个、10ml吸量管2支三）大肠埃希菌检查法一一常规平板法检查1、供试液的稀释用吸量管吸取葡萄糖酸钙口服药液10ml,到装有90mlpH7,0氯化钠-蛋白陈缓冲液的锥形瓶中，混匀，得到1:10的供试液。2、阳性对照试验取1：

5、10供试液10ml和1ml含菌量10100cfu的大肠埃希菌菌悬液加入增菌培养基，按大肠埃希菌检查法检查，作为阳性对照，应为MUG3性、靛基质阳性，检出大肠埃希菌。3、增菌培养取1：10供试液10ml（相当于供试品1g）接种于BL增菌培养基，培养1824小时。4、MUCM养各取上述培养物0.2ml,分别接种到两支5mlMUGS养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUGg养基做本底对照。然后沿管壁加靛基质试液数滴观察。5、分离培养（教师做阳性板给学生看大肠埃希菌的菌落形态）用接种环沾取需进一步检查的培养物划线接种于EMBff板上，培养1824h。检查有无

6、疑似大肠埃希菌菌落，若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验。6、结果分析1） MUG靛基质结果判断MU鼾养结果：在366nm紫外线下观察靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试液本色，为靛基质阴性MUG日性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUGm生、靛基质阴性，判未检出大肠杆菌；MUG日性、靛基质阴性或MUCK性、靛基质阳性，需进一步做以下检查2） EMB®养结果判断EMBW养18-24h后，检查有无疑似大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形态特征见表），若无，判供试品未检出大肠埃希菌；若有，进一步做以下试验大肠埃希菌落形态特征大肠埃希菌菌落形态特征A口加工菌落形态EMB

7、呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，微突起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常后金属光泽3）结果记录3035c培养项目供试品阳性对照MUG靛基质结果：口未检出/g(ml)口检出/g(ml)检验依据：2010年版？中国约典？二部附录J微生物限度检查法检验标准规定：口服制剂细菌数1g不得超过1000个；1ml不得超过100个。霉菌及酵母菌数1g不得超过100个。控制菌1g(1ml)不得检出大肠埃希菌。结论：本品按2010年版？中国药典？二部附录XIJ微生物限度检查法检查，结果：四、注意事项1 .实训过程要严格无菌操作。2 .供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再取，供试液从制备至加入培养基不得超过1h。3 .掌握好培养基的倒入温度，不宜太高或太低。4 .平板要倒置培养，掌握培养温度与培养时间。5 .计数菌落可用放大镜检查，以防漏数。若平板上有片状、花斑状菌落或蔓延生长成片，该平板无效。6 .配制MUG培养基时，务必调pH,否则pH偏高，MUG分解，本身则显荧光。7 .若营养琼脂培养基中生长的真菌菌落数多于玫瑰红钠琼脂培养基中的