BRET技术在G蛋白偶联受体和β-+arrestins相互作用

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。BRET技术在G蛋白偶联受体和-+arrestins相互作用BRET技术在G蛋白偶联受体和-+arrestins相互作用BRET技术在G蛋白偶联受体和- arrestins相互作用研究中的应用进展 杜辉 基金项目 国家自然科学基金( 30870932)；国家自然科学基金(30971081)；山东省自然科学基金（ZR2009D2004）Supported by National Natural Science Foundation of China (30870932), National Natural

2、 Science Foundation of China (30971081)，Shan Dong provence Natural Science Foundation(ZR2009D2004).通讯作者(Corresponding author). Tel: E-mail：bbai作者简介 杜辉, 在读博士，讲师. E-mail：hdu834100, 2，白波3* ，陈京11. 泰山医学院神经生物学研究所，泰安271000；2. 山东农业大学生命科学院， 泰安271000； 3. 济宁医学院神经生物学研究所，济宁272000 摘要 G蛋白偶联受体（G prote

3、in-coupled receptor, GPCR）是一个重要的细胞膜受体超家族。-arrestin1和2是广泛存在于细胞内的调配器和支架蛋白质,它们在G蛋白偶联受体的细胞内信号转导、脱敏、内化、复敏以及G蛋白非依赖的信号转导中发挥重要的作用。最近在生物发光共振能量转移（BRET）技术的发展能够实时监测活细胞内GPCRs和-arrestins的相互作用，可进一步阐明-arrestin调节GPCRs的功能，有助于开发新一代影响GPCRs功能活动的药物。 关键词 - arrestin； G 蛋白偶联受体；信号转导；生物发光共振能量转移；BRET中图分类号 R329.10 文献标识码 A Progr

4、ess of research on the interaction between G protein-coupled receptor and - arrestins using BRETtechnologyDU-Hui 1 ,2 , BAI- Bo3*, CHEN- Jing31. Department of Neurobiology,Tai shan Medical University,Taian,271000,China 2Department of Life Science,Shandong Agricultural University,Taian,271000，China 3

5、Department of Neurobiology, Ji ning Medical University, Jining, 272000，China Abstract G Protein-coupled receptors constitute a super family of cell surface proteins. -arrestin 1 and 2 are widely expressed intracellular adaptor and scaffolding proteins that play important roles in G protein-coupled r

6、eceptor desensitization, internalization, intracellular trafcking and G Protein-independent signalling. Recent developments in bioluminescence resonance energy transfer （BRET）technology enable monitor the GPCR-arrestin complexes in live cells and real time. In concert with a range of experimental to

7、ols, investigators can elucidate the ever-expanding roles of -arrestins in mediating GPCR function, which will be benefit for developing new generation drugs targeting GPCRs. Key words -arrestin; G protein-coupled receptor; signaling transduction; bioluminescence resonance energy transfer; BRETG蛋白偶联

8、受体(G protein-coupled receptor, GPCR) 是目前所知最大的细胞表面受体家族,由占人类基因组3的基因编码的1000多个成员组成，是药物研发中最广泛应用的药物靶点，约50市售的药物直接作用于GPCRs。传统的GPCR响应无数胞外信号分子的刺激被激活，暴露与G蛋白的结合位点，活化的G蛋白亚基调节腺苷酸环化酶、磷脂酶和离子通道等,放大和传递细胞内信号。GPCR和G蛋白、GRK(G-protein-coupled receptor kinases, GRKs)以及- Arrestin的相互作用很大程度决定信号传导的效率和选择性。-arrestin作为磷酸化活化的GPCR主

9、要结合配体，与G蛋白偶联受体激酶联合作用,可以使GPCR发生脱敏反应,调节受体内吞、信号转导等调节受体的功能1。大量研究表明, -arrestin可以在G蛋白不被激活的情况下,从活化的受体上直接启动信号转导。本文主要对应用生物发光能量转移技术(bioluminescence resonance energy transfer，BRET) 研究G蛋白偶联受体和- arrestin相互作用的进展进行综述。 1 - arrestin与 GPCR的相互作用 G蛋白偶联受体通过与配体结合，激活细胞内的G蛋白或- Arrestin，从而激活不同的细胞内信号通路，产生不同的生物学效应2。根据- Arrest

10、in在GPCR的信号通路中的作用分析二者的关系。 1.1 脱敏 脱敏是指受体受到连续刺激后失去反应性的现象。绝大部分GPCR都发现了受体脱敏现象。GPCRs脱敏的主要机制之一为：GRKs磷酸化激动剂激活的受体丝氨酸/苏氨酸残基，然后-arrestin被招募到磷酸化的受体上。-arrestin与GPCRs结合形成三聚体,使GPCRs与G蛋白异聚体解偶联, 从而导致G蛋白依赖性信号的大大减少或可以诱发受体内化，此过程称为脱敏。在新纹状体神经元中，研究携带绿色荧光蛋白的D2受体与-arrestin的相互作用时发现：激动剂诱导的D2受体/ -arrestin1相互作用具有优先选择性，优先的选择内源性的

11、-arrestin1，-arrestin1、2与D2受体的第二、三胞内环和羧基末端结合3。1.2 -arrestin与G蛋白偶联受体的内化和循环关系 受体脱敏、活化的受体去磷酸化和复敏必需受体的胞吞作用。GRK的磷酸化和-arrestin的结合促进了受体的内吞。GPCRs的内吞是多途径的过程，大多数的GPCRs与-arrestin结合后,通过网格蛋白包被小体完成内吞，-arrestin成为受体内吞过程中的一个重要连接蛋白。被内吞受体的胞内运输模式与受体内吞区域的序列、磷酸化部位的构型和-arrestin的结合有关。最近的研究发现-arrestin可以调节内吞后GPCRs的运输模式，在GPCRs

12、的膜运输中起到了特别的作用。根据GPCRs与-arrestin结合的关系可将GPCRs分A、B两型(表1)。“A”型受体以2肾上腺素受体（2AR）为例，其羧基端含不丰富的丝/苏氨酸群，它们瞬间募集-arrestin2运输到网格蛋白包被的小凹，内化后快速返回到胞瞙，A型受体被激活后短暂、快速的与-arrestin结合（以-arrestin2为主），且亲和力低。B型受体以血管紧张素1受体（AT1AR）为典型，受体同时募集-arrestin1和-arrestin2，并且与- arrestins结合力量强，结合时间更长，然后B型受体与网格蛋白包被小凹、- arrestins入内吞囊泡，受体循环到细胞表

13、面比A型受体慢的多 4。近来研究发现某些受体不完全符合这种分类方法，如利用酶联免疫吸附试验，共聚焦定位，BRET剂量反应试验的研究表明，两种食欲素（Orexins）受体与arrestin蛋白以B类受体特点内化、并迅速的返回质膜（具有A型受体特点）5。值得注意的是，配体激活相应受体后形成的受体-arrestins复合物的性质和稳定性反映了-arrestins的作用大小和受体未来的命运。Dennis KE等6利用激光共聚焦显微镜观察显示：apelin受体在内源性配体apelin-13的激动下受体内化后快速返回到细胞膜，apelin-36诱导的受体与-arrestin 1结合内吞却长时间被滞留于在胞

14、质内。 目前的研究发现,-arrestin的泛素化和去泛素化与受体运输模式有关。Perroy J等7利用BRET技术在活细胞中实时检测到-arrestins的泛素化。刺激A类受体导致短暂的-arrestins泛素化。与此相反，刺激B型受体后，-arrestins被招募到细胞膜，随后受体-arrestins复合物内吞到内涵体，导致持续的-arrestins泛素化。因此arrestin泛素化状态对于阐明arrestin与GPCRs的相互关系或内化机制可能起着关键作用。表1 GPCRs 的A型和B型受体的特征区别特征代表分子结构特征arrestin结合胞内循环A 2肾上腺素受体C-端没有丰富的丝/苏

15、氨酸群短暂、快速，低亲和力的结合-arrestin（以-arrestin2为主）短暂-Arrestins泛素化，快B血管紧张素1受体C-端含丰富的丝/苏氨酸群结合力量强和结合时间更长，同时募集-arrestin1和-arrestin2持续-Arrestins泛素化，慢1.3 -arrestin在GPCR的G蛋白非依赖信号转导中的作用 尽管-arrestin是在减弱受体信号转导的背景中发现的，但近年的研究提示，-arrestin可以从其要“脱敏”的特定受体上直接启动信号转导而不依赖G蛋白的激活。-arrestin成为Src家族酪氨酸激酶的调节因子,也是一些细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun

16、氨基端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的支架蛋白,对GPCRs的功能活动进行调节8。G蛋白依赖信号和-arrestin引发的效应的交互作用很大程度决定了以GPCRs为靶点药物的细胞内疗效。最近的研究9表明偏爱-arrestin的配体（biased ligands）能够选择性激活G蛋白或-arrestin，从而引起显著的生物学反应。利用敲除-arrestin基因，小分子干扰RNA技术以及受体突变的研究方法发现许多的GPCRs如µ-阿片受体、血管紧张素II1型受体、ß2-肾上腺素受体、甲状旁腺激素受体1型等都可以在无G蛋白信号转导的情况下激活-arresti

17、n而发挥效用。Ahn 等10的研究显示：AT1AR激活ERK1/2的机制是通过G（q）蛋白或-arrestin2完全不同的两个途径。Jonathan等 11利用BRET方法发现ß2AR的三种激动剂：乙基去甲肾上腺素、去甲肾上腺素和乙基异丙肾上腺素都具有明显的-arrestin信号转导的高亲和力，结构分析显示三者都具有儿茶酚胺-碳乙基化序列，而其它的相关配体并不具备此序列。现在最有效治疗心力衰竭药物的作用靶点是-肾上腺素能受体（1AR和2AR）和血管紧张素型1A受体（AT1aR）,这些受体的配体不仅能阻止导致心力衰竭的有害的G蛋白介导的途径，同时能通过招募-arrestin引起G蛋白非

18、依赖的信号途径而保护心脏，所以-arrestin成为治疗心力衰竭药物的潜在治疗靶点12。评价-arrestin的信号效应和功能的研究方法很少。-arrestin效应的检测方法最单一的是测量-arrestin转位到受体上, 研究者通过利用激光共聚焦显微镜观察荧光标记的-arrestin转位到激活的受体上和利用BRET的方法检测-arrestin与受体的相互作用发现：-arrestin偏爱的配体可能为-arrestin作为治疗靶点提供重要的理论依据。-arrestin偏爱配体的阐明以及-arrestin信号转导的证实也将使-arrestin偏爱的配体成为药物研发中的活跃领域。2 BRET 技术及其

19、在G蛋白偶联受体和- arrestin相互作用研究中的应用传统的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术有：酵母双杂交、免疫共定位，免疫共沉淀以及谷胱甘肽-S-转移酶牵出试验等，这些方法步骤繁多，多数只能在体外进行，有可能会改变蛋白质-蛋白质相互作用的自然状态。BRET技术是近几年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。它克服了传统的蛋白质相互作用检测方法对蛋白具有损害性的特点并能使在活细胞内实时、动态开展试验成为可能，大大提高了信息的获得量，而且可验证新的假说和理论。BRET技术的原理是建立在非辐射能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体发光酶和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体eYFP）

20、之间会发生能量转移。供体发光酶在相应的底物存在时发射光波。能量受体是荧光蛋白，在一定波长范围内吸收光波，并在一定的波长范围内发射光波。能量供体（发光酶）和能量受体（荧光基团）之间能量转移发生在供体的发射光谱必需与受体的激发波长相重叠(图1A)；供体和受体的空间距离接近（d10nm），一般可以发生能量的转移，两个目的蛋白之间距离足够近并发生相互作用，即可检测到BRET信号(图1B示)。BRET 种类很多，研究者可根据几种BRET 的特点选择适合研究特定蛋白质之间相互作用的BRET方法。最早的BRET1实验中，使用海肾荧光素酶(Renilla luciferase, Rluc)和加强型YFP（eY

21、FP）,以h- coelente -razine作为荧光素酶的底物,通过一个荧光素酶反应作为激发受体分子的能量来源。然而，荧光素酶产生的光谱以及eYFP的发射光谱是连续的，造成背景值较高，需要进行仔细的空白对照实验。最近两年来，人们开始使用BRET2,该技术使用另一种荧光素酶底物DeepBlueC。DeepBlueC氧化产生的光谱与改进型的GFP2发生能量转移，并且能把GFP发射光谱与DeepBlueC氧化产生的光谱区分开来，大大提高了BRET的信噪比。延长型BRET（extended BRET）又称eBRET可在底物荧光素底物前体EnduRen存在下，连续几个小时适时检测某个特定的相互作用或

22、高通量筛选多个样品而不需要频繁加入底物13。以上几种BRET技术都需要：构建供体发光酶与兴趣蛋白、受体荧光素与兴趣蛋白融合体并通过试剂分析、信号转导分析、共定位等技术证明蛋白融合没有改变兴趣蛋白的功能；细胞培养和转染；BRET信号检测和数据分析等步骤。虽然BRET技术比荧光共振能量转移（FRET）技术对能量转移信号更敏感14，但是单独利用BRET技术不能确定相互作用蛋白的细胞内定位，通过结合免疫荧光激光共聚焦技术可以弥补其不足。BRET技术应用日益广泛。首先是被应用于研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用。利用BRET技术进行的研究约50%集中于研究细胞膜上GPCRs之间的相互作用，如研究GPCR

23、s的同源和异源二聚化、受体激活和信号转导途径15-18。从理论上讲如果将- arrestin蛋白标记上荧光蛋白，在GPCR的C端标记上能量的供体，可以检测- arrestin从细胞质转移到细胞膜的运输过程。实践证明将供体或受体连接到GPCRs的胞质C-端，将- arrestin的N-端或C-端连接供体荧光酶或受体荧光素都能够成功得到BRET信号。Qiu等19用BRET技术研究了HEK293细胞中- arrestin与GPCR之间的相互作用，结果显示，激动剂激活的DOR不发生磷酸化时其第三个胞内环和羧基末端与- arrestin1和- arrestin2结合。Klewe等通过BRET方法证明，多

24、数抗精神病药不能刺激- arrestin与多巴胺D2 受体的结合20。Bernard Masri 21利用生物发光能量转移方法结合激光聚焦显微镜结果显示：氟哌啶、氯氮平、阿里哌唑、冬眠灵、喹硫平、奥氮平、利哌酮、齐拉西酮等一系列的抗精神分裂症的药物有一个共同的分子机制是抑制D2LR/-arrestin介导的信号而不是D2LR/Gi/o途径，因此选择性以D2LR/-arrestin 2的相互作用和相关的信号途径将为抗精神病药物的开发提供广阔前景。BRET技术的最大优势是能在活细胞中实时、动态地进行蛋白质-蛋白质相互作用的研究，更适合细胞内生理条件下生物化学反应的实际，本实验室进行的BRET实验选

25、用多功能荧光发光分析仪（FLUOstar OPTIMA,BMG LABTECH公司），它可用于对96孔和384孔微量板进行高通量检测，本所已经对Apelin受体(APJ)的信号转导进行了研究，取得了一些进展22。现在正利用BRET 技术对Apelin受体与其它GPCRs之间的相互作用进行检测，其目的是探讨血管活性肽与此相关GPCR之间的网络调节关系，对APJ及其突变体与- arrestin之间的相互作用进行研究，以进一步理解GPCR的病理生理过程并有助于新药开发。3 结 语BRET技术为我们提供了在生理活细胞实时、动态检测蛋白质与蛋白质相互作用的途径。GPCRs作为主要的药物作用靶点，其功能的

26、调节是一个非常复杂的过程。GPCR与-arrestin的相互作用持续时间比GPCRs与G蛋白相互作用的持续时间长，特别是B型GPCR 的受体与-arrestin的结合、分离、重新结合的时效关系依赖循环机制和溶酶体的降解程度需要长时间的GPCR与-arrestin相互作用的检测。随着人们对-arrestin调节功能认识的增加，特别是-arrestin介导信号传导途径研究的深入，有必要长时间实时、动态的检测激动剂刺激后GPCRs与-arrestins的相互作用。进一步阐明-arrestin在调解G蛋白偶联受体的功能，对于开发新一代影响GPCRs的药物具有重要应用价值。参 考 文 献1 Gurevi

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