果树种质资源鉴定及DNA指纹图谱应用研究进展

1、第 22卷 第 1期 2000年 1月北 京 林 业 大 学 学 报JO UR NAL OF BEI JI NG F OREST R Y U N IV ERSIT YVol. 22, N o. 1Jan. , 20001999-07-16收稿http:/ww w. chinainfo. gov. cn/periodi cal/bjlydxxb/*(/0果树种质资源鉴定及 DNA 指纹图谱应用研究进展 *宋 婉 续九如(北京林业大学资源与环境学院 , 100083, 北京 ; 第一作者女 , 28岁 , 博士 摘要 该文对应用于果树种质资源鉴定的各种方法进行了系统的论述 . 文中介绍了传统的 形

2、态学、 孢粉学、 细胞学 以及 蛋白质凝胶电泳方法在果树种质资源鉴定方面的应用 及能解决 的问题 ; 论述 了目前 5种重 要的 DN A 指纹图 谱方 法 , 即 RF LP 、 RAPD 、 小卫星 DN A(V NT R 、 微卫星 DNA (SSR 和 AF LP 的特点 以及在果 树种质资源 鉴定中的 具体应用 , 并对指纹图谱方法在果树遗传研究等 方面的应用前景进行了分析 . 关键词 果树 , 种质资源鉴定 , DNA 指纹图谱 中图分类号 S660. 1Song Wan; Xu Jiuru. Progress in application of germplasm identif

3、ication an d fingerprinting of fruit trees. Journal o f Beij ing For estry Universtity (2000 22(1 7680Ch, 24ref. College of Forest Resources and Environment, Beijing For. Univ. , 100083, P. R. China.Various methods which have been applied in identification of fruit tree g ermplasm were discussed in

4、the paper. Applications and restrictions of the traditional morphological, palynological, cytological, and protein gel electrophoresis methods w ere summarized. M oreover characteristics and applications of the new ly developed DNA fingerprinting methods in this field such as RFLP, RAPD, VNTR, SSR,

5、and AFLP w ere also review ed. T heir prospects of applications in other areas of genetic research w ere analyzed.Key words fruit tree, germplasm identification, fingerprinting 果树种质资源不仅包括栽培品种 , 而且也包括 半栽培品种和野生果树的种、 变种和类型 , 是遗传上 高度杂合性的多年生木本植物 , 而且在生产上重要 的果树品种一般都以嫁接、 扦插、 压条等方式进行无 性繁殖 , 果树种质鉴定尤其是优良类型和品种

6、的鉴 定已成为果树育种的基础和发展生产的前提 . 随着 经济的发展 , 许多果树新品种在不断地被选择和创 造出来 . 种质鉴别和品种鉴定不仅对种苗部门而且 对各相关部门都具有重要的意义 . 从直观的形态学 到 DNA 水平 , 许多方法可以用来进行种质鉴定 , 根 据某一特定果树的交配方式的不同 , 其鉴定方法、 取 样方法及分析方法也会不同 .1 传统的果树种质鉴定方法1. 1 形态学方法形态学性状便于观察和获取 , 性状变化复杂多 样 , 具有最长的研究历史 . 目前大多数果树种质鉴定 依据所研究树种最鲜明的形态特征进行区分、 分类和命名 . 但是形态性状尤其是营养器官容易受环境 修饰而发

7、生变化 , 而且品种水平上的形态差别很少 , 有时无法进行品种鉴定 . 由于标记数量的限制 , 形 态学标记已明显跟不上对越来越多的自然选育和人 工培育的果树品种进行鉴定的要求 . 1. 2 孢粉学方法花粉的形态特征受植物基因型控制而不受外界 条件影响 , 是探讨植物起源、 演化及亲缘关系的重要 特征之一 . 许多学者在应用孢粉学方法进行果树种 质资源鉴定 方面做 了许多 有益 的尝 试 . 已 经对 梨 属 1、 枣 2、 猕猴桃 3等果树 树种进行了较为 详细 的 研 究 . 国 外 一些 学 者 4提出 建 立 /花 粉指 纹 档 案 0, 对于品种识别、 原始材料管理无疑是有用的 .

8、在应用孢粉学方法进行果树种质鉴定分类时要 注意制样方法的影响 5, 并且即使同一品种内花粉 粒之间存在个体差异 . 所以如果仅以个别花粉性状 的差异作为分类鉴定依据有时并不可靠 , 必须结合 其它指标进行综合考察 .1. 3细胞学方法细胞学方法是从本世纪 30年代起兴起的一种 利用染色体数目、 核型、 分带带型、 减数分裂的行为 分析等进行植物分类的方法 . 这种方法也被应用到 果树资源鉴定中 9. 由于多倍体在果树育种和应用 中的重要性 , 对染色体进行观察可以直观地发现和 鉴定果树种质资源中的多倍体 , 从而迅速地应用到 果树遗传育种和生产中 . 许多学者就是在他们的染 色体研究中发现了多

9、倍体 6, 7.染色体研究的实验条件相对简单 , 结果快 , 尤其 是结合分带技术可以揭示出大量 染色体结构的变 异 , 但是由于染色体制片技术和分辨率的限制 , 核型 分析应用于品种鉴定还有一定的难度 , 对于大多数 具有小染色体和结构差异较小的果树植物来说 , 染 色体核型分析还不足以达到进行品种鉴定的目的 . 但是随着植物染色体制片技术的日益成熟和各种分 带技术 , 染色体原位杂交技术等的发展和应用 , 细胞 学方法在将来可能会成为果树品种资源鉴定的一个 有效手段 .2蛋白质凝胶电泳和果树种质鉴定 在果树植物中 , 存在许多高度多态性的蛋白质 , 对各种蛋白质又有许多不同类型的电泳方法

10、.2. 1常用的凝胶电泳方法根据分析方法的不同常用的凝胶电泳方法可以 分为两种主要类型 :¹蛋白组分的直接比较 . 在这种 分析中 , 某两个品种间的差异标准即为某一位置上 某一条或一组蛋白质条带的 /有 0或 /无 0. º蛋白质 带型发生频率的间接比较 , 即通常所说的同工酶或 等位酶分析 , 是在若干个或一个位点上统计某一酶 带的出现频率 . 一般说来第 1种方法对于由近交系、 F1代杂种和无性系组成的品种群更加适合 , 而第 2种方法可以用于异花授粉的种质资源 .21111蛋白质分析 最广泛地用于种质鉴别的蛋 白即种子蛋白 , 其组分的差异可以反映出基因型的 不同

11、, 因而可以用作品种的 /生化指纹 0. 种子蛋白分 析在大多数作物的品种鉴定和品质评价方面得到了 广泛应用 8, 9. 在一些重要作物上 , 国际种子检验学 会 (ISTA 已颁布了应用 PAGE 方法鉴定品种的标 准程序 , 许多国家已建立起了种子蛋白指纹图谱数 据库 10. 在果树上 , 朱立武 11用叶片和种子蛋白质 为材料对柑橘进行了研究 , 肯定了叶片蛋白质电泳 带型在种间的差异和种子蛋白质电泳带型在种以下 分类单元间的差异 .21112酶分析 酶电泳技术直到 70年代才开始应 , 为目前果树品种鉴定、 雌雄株鉴别、 研究系统与演化 的一项重要手段 . 果树同工酶研究几乎涉及到所有

12、 种类的树种 , 目前经常测定的酶系统估计也有 30种 之多 . 应用同工酶进行果树资源研究有如下优点 :¹避免趋同进化和性状功能相关等问题 ; º谱带简 单明确 , 较少主观性 ; »受环境影响较少 ; ¼不存在 加权问题 ; ½共显性 , 可以区分杂合和纯合 ; ¾实验 设备简单 , 材料来源丰富 , 成本较低 , 分析时间快且 结果便于比较 .自从 Esen 最早在果树分类上应用同工酶技术 以来 , 同工酶分析在越来越多的果树树种中得到了 广泛 的应 用 12, 国 内 学 者也 利 用 多 种 酶 系 统 在 枣 13、 杏

13、14等树种中开展了研究 , 取得了较好的结 果 . 但是国内有些学者大多是利用过氧化物酶同工 酶 (POD 进行研究 , 这时应该考虑到以 POD 为代表 的同工酶遗传背景较为复杂 , 对于最终获得的谱带 应该做十分认真和仔细的分析 . 因为同工酶的谱带 型式会因构成该酶多态数目、 编码基因位点数目及 分析个体基因组成而有很大变化 , 因此凝胶上的酶 谱这种电泳表型既有它的遗传背景 , 也会受生理和 人为等因素的影响 , 并不能直接反映 DNA 水平的 情况 . 所以 , 进行特定的遗传分析是酶电泳技术一个 不可缺少的步骤 15.2. 2其它凝胶电泳方法还有其它一些凝 胶电泳方法 , 如 SD

14、S-PAGE 方法 , 等电聚焦电泳 (IEF , 双向电泳等 , 比传统的 蛋白质和同工酶电泳 方法有更高的分辨率和 重复 性 , 在许多作 物上已有大量应 用 8. 但是这些 方法 比较复杂 , 有的需要价格昂贵的两性电解质 , 因而在 果树上用得较少 .3DN A 指纹图谱分析方法/DNA 指纹图谱 0一词可以泛指一切具有某一 种质特异性的谱带 , 借助指纹图谱 , 可以区分不同的 种质资源 . 指纹图谱是鉴别品种、 品系的有力工具 . 80年代中后期 , DNA 分 析技术开始大量 应用 于植物学研究 , 一些以前用蛋白质电泳和酶电泳等 无法解决的问题也迎刃而解 . 与形态性状、 细胞

15、学性 状、 孢粉学性状以及蛋白质多态性状相比 , DNA 指 纹图谱具有无与伦比的优越性 :它们对表型无影响 ; 而且基因组 DNA 的变异极其丰富 ; 在发育的不同 阶段 , 不同组织的 DNA 都可以用于分析 , 也使得对 果树这样生长周期长 的植物进行早期鉴定成 为可 能 . 近年来随着分子生物学的迅猛发展 , 许多 DNA 分析技术相继涌现并迅速用于植物研究中 . 已经和 5 77第 1期 宋 婉等 :果树种质资源鉴定及 DNA 指纹图谱应用研究进展种 .3. 1RFLP 分析限制性内切酶酶切片段长度多态性 (RFLP , 是 近年来发展起来的以生物基因组 DNA 序列变异为 基础研究

16、不同基因组差异的一项新技术 . RFLP 不 受显隐性关系、 环境条件和发育阶段的影响 ; 在数量 上不受限制 , 检测方便 ; 具有稳定遗传和特异性 ; 而 且用于检测 RFLP 的克隆探针可随意选择 , 可以是 核糖体 DNA, 叶绿体 DNA 或总 DNA, 这样就可以 产生大量的多态性 , 为研究植物类群特别是属间、 种 间甚至品种间的亲缘关系、 系统发育与演化提供有 力的依据 .应用 RFLP 技术作为遗传工具始于 1974年 , 从 80年代起开始应用于植物 , 如玉米和番茄上 , 之后 其他作物中的 RFLP 研究相继开展 , 目前主要用于 各种植物遗传连锁图谱的绘制和目的基因的

17、标记 , 它在品种鉴定上的应用也已广泛开展起来 . 国外在 大麦属、 稻属、 桉属、 苏铁科等多种植物上进行了研 究 16. RFLP 由于技术复杂 , 所需 DNA 量大 , 对所 研究对象需要有一定的遗传背景知识 , 国内在应用 RFLP 技术进行果树种质资源的研究局限于少数类 群如柑橘 17、 葡萄属植物 18中 , 在其它果树树种上 未见利用的报道 .3. 2RAPD 分析随机扩增 DNA 多态性 (RAPD 是 J. Williams 和 J. Welsh 两个研究小组在 1990年发展起来的一 种新型遗传标记 19, 20, 它是以人工合成的随机引物 对基 因组 DNA 进行扩 增

18、而产生 能显示多 态性的 DNA 指纹图谱 . RAPD 是一种基于序列的多态性 , 由于可以在没有任何分子生物学研究基础的情况下 对某一物种进行指纹图谱的构建、 遗传多样性的研 究 ; 相对于 RFLP 来说比较经济简便 , DNA 用量也 少 (ng 级 ; 而且避免了使用放射性同位素 , 因而近 年来在果树品种资源鉴定方面得到了广泛的应用 . 国外从 1993年就开始将 RAPD 技术用于植物 品种鉴别中 , 已成功地应用于苹果 21、 葡萄 22、 猕 猴桃 23、 桃 24、 香 蕉 25、 柑 橘 26、 杏 27以及 番荔 枝 28、 柿 29、 草莓 30、 悬钩子 31、 芒

19、果 32等经济价 值比较高的果树树种中 , 在保护育种者的权益方面 很有帮助 . 国内学者利用 RAPD 技术对枣 33、 葡萄 属 34、 梨属 35等多种果树树种进行了研究 , 普遍认 为 RAPD 分析可以达到对果树不同种质资源进行 鉴定的要求 .但是 , 从文献和作者的经验来看 , RAPD 在目前 主 要 存 在 以 下 两 个 问 题 :¹重 复 性 和 稳 定 性 较 差 36, 对果 树 品 种 进 行 RAPD 分 析 之 前 , 要 反 复 进 行 RAPD 反应条件优化实验 , 以得到令人信服和可靠 的结果 . ºRAPD 过于灵敏 , 而且一般为显性

20、标记 , 有时会使遗传分析变得复杂化 37. 因为有的 RAPD 标记不依照预期的遗传样式 , 在做图和遗传多样性 研究中运用 RAPD 标记时应当非常谨慎 .3. 3小卫星 DNA(VNTR19801984年 , 人类遗传学家相继在人体基因 组中发现了一些串联重复序列 , 这些序列由长度为 1160bp 的核心序列串联重复而成 , 后来称之为 小卫星 DNA. 由于重复单位的数目不同和重复拷贝 数的等位性不同 , 使其表现出高度 多态性 . 不 同生 物、 同一生物的不 同品种 , 甚 至同一品种的不 同个 体 , 其所含小卫星各异 , 杂交产生的图谱各不相同 , 谱带遵循孟德尔遗传 方式遗

21、传并具有体细胞 稳定 性 . 这些特点使之成为目前较先进的遗传标记系统 而广泛应用在许多作物的品种鉴定和遗传多样性研 究中 38. 这一方法国内在果树上还未见有报道 . 3. 4SSR(微卫星 技术SSR 是一类由几个核苷酸 (一般为 15个 为重 复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列 . 植物体内的二核苷酸重复 (AT n 远比 哺乳动物丰 富 , 植物基因组中平均每隔 2Kb 就有一个三核苷酸 或四核苷酸重复 , 且每种类型的 SSR 在不同的物种 中出现的频率不同 . SSR 多态性的信息量非常丰富 , 具有所有 RFLP 的遗传学优点 , 又比 RAPD 重复性 能和可信度高 ,

22、 因而是目前遗传标记中的热点 . 但是 由于 SSR 必须针对每个染色体座位的微卫星 , 发现 其两端的单拷贝序列以设计引物 , 因而给 SSR 标记 的利用带来了一定困难 , 然而一旦开发出某种生物 的 SSR 标记 , 就又 显现出该标记的利用价值 . SSR 目前已广泛应用于许多农作物中 39.3. 5AFLP 技术AFLP 技 术 是 1993年 由荷 兰 生 物技 术 公 司 KEYGENE 的 Zabeau 和 Vos 等人发明的 , 已申请了 专利 40. AFLP 实际上是 RFLP 和 PCR 相结合的一 种方法 . 与 RAPD 一样 , AFLP 可以用于没有任何 分子生

23、物学研究基础的物种 , 其引物在不同物种间 是通 用的 , 被 称为一种 /半随机 0的扩增 . 一 个 015 mg 的 DNA 样品 , 可做 4000个 AFLP 反应 , 获得 8万个标记 , 650万条带纹 . 可见 AFLP 的多态性非常 高 . 利用放射性标记或银染方法在变性的聚丙烯酰 胺凝胶上通常可检测到 50100个扩增产物 , 而且 重复性强 , 因而非常适合于品种指纹图谱的绘制、 遗 传连锁图的构建及遗传多样性研究等 .,78北 京 林 业 大 学 学 报 第 22卷在蔬菜、 林木 (垂枝桦、 辐射松等 以及拟南芥上广泛应用 41. 多数作物上的研究结果都表明其产生的多

24、态性远远 超过 了 RFLP 、 RAPD 等 , 目 前被 认为是 DNA 指纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术 . 实际上 , AFLP 最适的应用范围 , 也是 Zabeau 和 Vos 申请专利的关键 , 就是利用 AFLP 技术鉴定品种的 指纹 , 检测品种的质量和纯度 . 目前国内在果树上的 应用刚刚兴起 , 祝军 42、 宋婉 43分别应用 AFLP 银 染法、 荧光法在苹果、 枣上做了有益的尝试 .4指纹图谱的应用从以上分析中可以看出指纹图谱分析无疑为果 树种质鉴定提供了一种强有力的技术 . 除此之外 , 它 们在遗传研究和果树生产中有非 常广泛的实际应 用 , 包括 :(1

25、 在果树育种中 , 可以作为重要性状遗传标记 的来源 , 为开展用分子标记进行抗性选择育种工作 奠定了一定基础 . 在一些自花授粉果树的杂交育种 中 , 也可用指纹图谱鉴别杂种苗和亲本自交苗后代 . 指纹图谱技术可以鉴别有性杂种 , 也可鉴别体细胞 融合杂种和诱发突变产生的后代 . 用指纹图谱技术 还可以鉴别雌雄株 , 在一些雌雄异株的果树树种 (如 猕猴桃 中 , 如能在开花前鉴别出雌雄株将为果树育 种者带来很大的帮助 .(2 可以进行果树种质资源亲缘关系和谱系分 析 , 在收集果树野生、 半野生资源中可以进行遗传多 样性的分析 , 从而为科学地进行果树种质资源的基 因库保护、 异地保存提供

26、重要依据 , 为确定保存种质 资源的量的大小、 点的选择 , 最小繁殖群体的确定及 核心果树种质的筛选奠定基础 .(3 用于野生、 栽培果树种以下变种、 品种、 类型 的分类研究 . 品种的分类问题一直未能得到明确的 解决 . 品种的分类作为一个系统的鉴别系统具有商 业和通用价值 , 在发展不同类型、 不同用途和起源与 野生种的亲缘关系方面具有重要的科学价值 , 因此 应用指纹图谱技术建立一个科学、 实用、 精确的种下 品种分类系统是十分有意义的 .(4 用于基因组作图 . 遗传图谱既是遗传研究的 重要内容 , 又是种质资源、 育种及分子克隆等许多应 用研究的理论依据和基础 . 目前许多果树种

27、类 (如越 橘、 木瓜、 苹 果、 柑橘、 桃 已 建起 基本 的遗 传连锁 图 4447, 这些重要工作为目的基因定位和克隆提 供了框架结构 , 为进一步数量性状基因位点 (QTL 定位、 分子标记辅助育种 (MAS 奠定了基础 .参 考 文 献1杨槐俊 . 孢 粉学在 部分 梨属 植物 分类研 究中 的应 用 . 果 树科 学 , 1985(3 :292李树林 , 曲泽洲 , 王永惠 . 枣品 种资源的花 粉学研 究 . 河北农 业大学学报 , 1987, 10(3 :193康宁 , 王圣梅 , 黄仁 煌 , 等 . 猕猴 桃属 9种植 物的花 粉形 态研 究 . 武汉植物学研究 , 19

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