蛋白质盐析实验注意事项及实验步骤_第1页
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1、.蛋白质盐析实验本卷须知及实验步骤蛋白质盐析实验本卷须知及实验步骤一、本卷须知：1. 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越容易沉淀。2. 盐析一般用的硫酸铵，容易吸潮，因此在使用前，一般先磨碎，平铺放入烤箱内60摄氏度烘干后再称量，这样更准确。3. 在参加盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，假如出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起部分的盐浓度过高，导致酶失活。4. 盐析后最好搅拌40分钟到一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。3.5为了防止盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。5. 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处

2、理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤或者G-25，G-50 处理。6. 一般粗提物蛋白完全沉淀是在硫酸铵浓度在70%左右。二、实验步骤：蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，由下表可以看出：它的优点是温度系数小而溶解度大20度时饱和溶液为754克/升;0度时饱和溶解度为706克/升，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进展盐析时，需用硫酸或氨水调节。表1 几种盐在不同温度下的溶解度克/100毫升水02080100

3、NH42SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101饱和硫酸铵法：1. 取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴参加2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。2. 4，3h以上，使其充分沉淀离心3000rpm,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。3. 置43h以上，此时，NH42SO4的饱和度为33%重复上述第二步过程12次。末次离心后所得沉淀物为蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。4. 对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。蛋白质在用盐析沉淀别离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内常用的是玻璃纸，用缓冲液进展透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较

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