发酵工程的研究状况和进展

1、1发酵工程的研究状况和进展发酵工程的研究状况和进展陈陈 坚坚江南大学江南大学2发酵工程的研究状况发酵工程的研究状况3生物质原料化学品化学品精细化学品精细化学品大宗化学品大宗化学品食品添加剂食品添加剂生物塑料生物塑料溶剂溶剂酚类酚类粘合剂粘合剂脂肪酸脂肪酸碳黑、颜料碳黑、颜料燃料、香料、墨水燃料、香料、墨水洗涤剂洗涤剂生物能源生物能源生物酒精生物酒精生物柴油生物柴油甲醇甲醇氢气氢气沼气沼气工业生物技术主要部分工业生物技术主要部分-发酵工程发酵工程4发酵：生物发酵：生物反应过程反应过程上游上游加工过程加工过程加工过程加工过程下游下游成本经济学成本经济学原料原料的生物的生物具有具有应用价值应用价值目

2、的产物目的产物大规模大规模工艺开发工艺开发传统诱传统诱变、分变、分子生物子生物学、组学、组学学发酵工程发酵工程广义的概念：生物学广义的概念：生物学(微生物学、微生物学、生物化学生物化学)和工程学和工程学(化学工程化学工程)结合结合t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 狭义的发酵概念：微生物培养狭义的发酵概念：微生物培养和代谢过程和代谢过程微生物生长微生物生长底物消耗底

3、物消耗产物生成产物生成5获得应用价值的微生物反应器及过程放大发酵过程优化和控制发酵工程研究发酵工程研究发酵产物分离提取6发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义微生物能够积累最大目的产物微生物能够积累最大目的产物(产量产量)的的条件条件是什么？是什么？ 高产量高产量 便于产品分便于产品分离提取离提取关键问题关键问题1工程意义工程意义1相关：微生物生理、遗传特性和营养、环境因素7底物最多被微生物转化为产物底物最多被微生物转化为产物(转化率转化率)的的条件条件是什么？是什么？粮食原料为底物粮食原料为底物 高转化率高转化率 降低原料成本降低原料成本关键问题关键问题2工程意义工程意义2

4、相关：微生物代谢途径和过程条件发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义8微生物最快速度发酵生产目的微生物最快速度发酵生产目的产物的产物的条件条件是什么？是什么？分批操作为主分批操作为主 高生产强度高生产强度 缩短生产周期缩短生产周期工程意义工程意义3关键问题关键问题3相关：微生物反应动力学和系统优化发酵工程的关键问题和工程意义发酵工程的关键问题和工程意义9条件确定过程优化初始条件过程分析过程强化发酵优化的研究思想：发酵是一个过程发酵优化的研究思想：发酵是一个过程10基于细胞表观特性进行优化基于细胞表观特性进行优化0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L)

5、 A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于细胞内部分析进行优化基于细胞内部分析进行优化高产量高产量高底高底物转物转化率化率高生高生产强产强度度优化策略优化策略在理论和技术上有突破在理论和技术上有突破, ,在工业生产中能广泛应用在工业生产中能广泛应用显著提高发酵过程的经济性和科学性研究方法研究方法111 1优化优化微生物生长的物理和化学环境微生物生长的物理和化学环境保证保证微生物生长处

6、于最适条件微生物生长处于最适条件基本思想奠定基础基于基于底物运输、生化反应、产物排出底物运输、生化反应、产物排出确定确定不同环境条件对微生物生长不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响和代谢产物分布的影响Prod. Distribution发酵优化12培养基组成的优化技术发酵环境条件的优化技术 确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足确定培养基组分的最小用量，避免底物的过量或不足减少副产物的形成，使底物转化率明显提高减少副产物的形成，使底物转化率明显提高对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产对关键物质的浓度及其供给方式进行优化，使目标产物产量明显提高量明显提高分析不同环境

7、条件下微生物的生理学分析不同环境条件下微生物的生理学目的 内容132基于微生物代谢特性的分阶段培养技术基于微生物代谢特性的分阶段培养技术控制环境条件在最适合细胞生长或最适控制环境条件在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平合产物合成的水平。目目的的分分析析不同不同T、pH、RPM、DO发酵过程的动力学参数发酵过程的动力学参数(，qp，qs)流变学参数的变化特性流变学参数的变化特性分阶段控制策略分阶段控制策略提提出出分阶段分阶段T、pH、RPM、DO发酵优化14利用利用分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物分阶段培养技术还可以将细胞生长期和产物形成期人为分开形成期人为分开，从而实现优化发酵过程的目

8、的。，从而实现优化发酵过程的目的。T，pH, DO, RPM153基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术建立动力学模型，求解参建立动力学模型，求解参数并评价其适用性数并评价其适用性对发酵进程和产量对发酵进程和产量指标进行预测指标进行预测ModelFormMonod Constant yieldu = umax s/(K m + s) Y x/s = Y0Substrate inhibition Constant yieldu = umax s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0Substrate inhibition Variabl

9、e yieldu = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition InhibitionsConstants yieldsu = umax s/(Km + s + s2/Ki) u = umax o (1 - P/P m )q p = alpha. u+ betaalpha, beta and Y p/s以数学模型为基础的优化优化发酵过程优化发酵过程发酵优化16 以生理模型为基础的优化以生理模型为基础的优化采用人工神经网络

10、、专家系采用人工神经网络、专家系统、模糊逻辑控制技术统、模糊逻辑控制技术对发酵过程对发酵过程进行在线状进行在线状态预测和模态预测和模式识别式识别自适应最优自适应最优化控制系统化控制系统的开发、计的开发、计算机模拟和算机模拟和实际应用实际应用174参参考考已知的生化反应计量关系、已知的生化反应计量关系、代谢途径、生理、特征，代谢途径、生理、特征，构建构建、合成不同产物的合成不同产物的代谢网络代谢网络。利用利用代谢通量分析方法，代谢通量分析方法，计算计算得得出胞内出胞内各条代谢途径的通量变化各条代谢途径的通量变化。发酵优化18分析分析不同发酵产品合成途径中不同发酵产品合成途径中主要代谢节点的性质主

11、要代谢节点的性质，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，结合发酵过程中胞内能量代谢情况，提出提出一系列发酵一系列发酵优化策略优化策略。 19长期胁迫可遗传性的应长期胁迫可遗传性的应答（遗传变异）答（遗传变异）短期胁迫不可遗传性的短期胁迫不可遗传性的应答（生理性的应答（生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP环境压力或胁迫环境压力或胁迫饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、饥饿、高温、高压、机械剪切、冷冻、强酸、强碱、高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等等高渗透压（高盐）、活性氧、有毒化学物质等等细

12、胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的细胞结构、基因转录和蛋白表达的临时改变，酶原的激活以及代谢途径的临时调整等激活以及代谢途径的临时调整等5基于基于环境胁迫条件下微生物生理应答的过程环境胁迫条件下微生物生理应答的过程优化技术优化技术发酵优化20研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫研究一些重要的工业微生物的抗胁迫因子及其抗胁迫机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代机制，考察环境胁迫条件下特定微生物蛋白转录和代谢途径变化，谢途径变化，采用不同环境胁迫手段或措施对微生物采用不同环境胁迫手段或措施对微生物的生长或代谢进行调控，促进微生物生长或大量合成的生长或代谢进行调控，促进

13、微生物生长或大量合成目的产物。目的产物。 学术思想学术思想21学术思想学术思想6基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术基于微生物代谢的辅因子调控的过程优化技术CofactorsMetal ionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins发酵优化研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢研究辅因子形式及其浓度在物质代谢和信号传递途径中控制代谢流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，流方向和流量分配的作用机制、物质流和辅因子流的变化规律，对微生物的生长或代谢进行调控，对微生物的生长或代谢进行调控，促进

14、微生物合成目的产物的代促进微生物合成目的产物的代谢流的最大化和快速化。谢流的最大化和快速化。 22蛋白质组学蛋白质组学 组学组学Discovery-driven转录组学转录组学代谢组学代谢组学 通量组学通量组学DNA芯片技术芯片技术二维电泳二维电泳/质谱技术质谱技术多维色谱多维色谱/质谱技术质谱技术同位素同位素-核磁共振技术核磁共振技术计算生物学计算生物学基因组模型化技术基因组模型化技术实验生物科学实验生物科学Hypothesis-driven分子遗传学分子遗传学分子微生物学分子微生物学蛋白质工程蛋白质工程结构生物学结构生物学代谢工程代谢工程重组重组DNA技术技术蛋白质结晶及蛋白质结晶及晶体衍

15、射技术晶体衍射技术酶的定向酶的定向进化技术进化技术高通量高通量筛选技术筛选技术微生物生理学微生物生理学反向代谢反向代谢工程技术工程技术细胞功能认识细胞功能认识和优化和优化生物学知识和技术生物学知识和技术23工程学方法和规律工程学方法和规律工业生工业生物物过程过程细胞群体效应细胞群体效应生化、生理特性分析生化、生理特性分析物质和能量传递模型物质和能量传递模型过程放大原理和策略过程放大原理和策略发酵优化发酵优化系统全局优化与集成系统全局优化与集成过程优化过程优化细胞群体效应调细胞群体效应调控的直接放大控的直接放大生物生物/ /化学方法化学方法级联的系统优化级联的系统优化多产物联产目标多产物联产目标

16、的全局调控的全局调控发 现发 现和 认和 认识识创 新创 新技 术技 术和 方和 方法法集成集成优化优化细胞细胞群体群体单元单元过程过程系统系统优化优化反应反应/ /分离单元耦分离单元耦合集成合集成生物生物/ /化学级联方化学级联方法法多目标联产方法多目标联产方法耦合技术耦合技术基于生理特性的直基于生理特性的直接放大接放大过程集成过程集成24发酵工程研究举例发酵工程研究举例25举例举例1：丙酮酸发酵：丙酮酸发酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA -KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1, NA)PDC (B1) PT

17、 (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素硫胺素NA： 烟酸烟酸Bio：生物素：生物素B6： 吡哆醛吡哆醛GlucosePyruvate如何得到丙酮酸高产量发酵？如何得到丙酮酸高产量发酵？-菌株选育和培养条件优化菌株选育和培养条件优化XXXX选育自身不能合成维生素的酵母选育自身不能合成维生素的酵母( (维生素缺陷型维生素缺陷型) )控制培养基中维生素浓度控制培养基中维生素浓度Li Y ，Chen J ， Lun S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55:680-685, 57:471-479.Li Y, Chen J, Liang D, Lun S-Y

18、. J. Biotechnol. 2000, 81:27-3426t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 动力学分析高高溶氧溶氧下，丙酮酸转下，丙酮酸转化率较高，但生产强化率较高，但生产强度度(葡萄糖消耗速度葡萄糖消耗速度)较较低低低溶氧下，葡萄糖消低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙耗速度加快，然而丙酮酸产率却明显下降酮酸产率却明显下降代谢网络分析PyrEt14.7P

19、EP74.65.5OAAAcCoA7.9PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9DO=10%PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7DO=85%PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸进一步代谢的通量下降了63.3%高溶氧下转化率高的原因如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度？-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制辅因子分析NADHATP39.0NADHATP39.0NADHATP20.7NADHATP20.7总总ATP下降下降31.4%, NADH下降下降18.6%生产

20、强度(葡萄糖消耗速度)59低溶氧生产强度高的原因DO=10%DO=85%Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2):173-185 Li-Ming Liu, *Jian Chen. FEMS Yeast Research, 2006, 6:11171129 27高产量高产量(89.4 g/L)高产率高产率(0.636 g/g)高生产强度高生产强度(1.95 g/(L h) 确定分阶段供氧模式:发酵0-16 h控制kLa为450 h-1，16 h后将kLa降低至200 h-1碳平衡分析前16 h较高溶氧有利于碳流合

21、成细胞；采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！采用单一高或低供氧模式，不能同时达到高转化率和高生产强度！16 h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸结果 016h 1632h 3248h after 48h kL a / h-1 450 300 200 450 300 200 450 300 200 450 300 200 Glucose1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cell growth2 47 30 27 17 13 16 13 13 11 3 10 11 Pyruvate 44 41 32 80 60

22、 55 83 70 57 82 78 41 Ethanol 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Residual carbon 7 27 39 3 27 29 5 17 32 14 12 48 如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度如何提高丙酮酸发酵的转化率和生产强度?-?-分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制分阶段溶氧控制！如何分阶段？分阶段溶氧控制！如何分阶段？Liming Liu,*Jian Chen. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4):825-832 Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Bio

23、technology, 2006, 126(2):173-185 28PC (Bio)OAAGlucoseAcetateAcCoAPDH bypassPyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA -KG10 g/L59g/LAGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass14 g/L53 g/LB辅因子调控辅因子调控打开丙酮酸脱氢酶

24、系打开丙酮酸脱氢酶系(PDH)途径途径打开丙酮酸羧化酶打开丙酮酸羧化酶(PC)途径途径29 L Liu, Y Li, Z Shi, G Du, *J Chen. Metabolic Engineering, 2007, 9(1):21-29 GlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyruvatePDH (B1)AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass21 g/L48g/LCGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyru

25、vatePDH (B1)AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass44 g/L22 g/LCaCO3D同时打开添加Ca2+离子，PC活性受Ca2+所激活30举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控我国是世界最大的维生素我国是世界最大的维生素C生产国和出口国，生产国和出口国，2008年生产年生产85000吨，产值吨，产值40亿，占世界市场亿，占世界市场90 小菌小菌(氧化葡萄糖氧化葡萄糖杆菌杆菌G. oxydans )大菌大菌(巨大芽孢杆巨大芽孢杆菌菌B. megaterium )关键科学问题：维生素关键科学问

26、题：维生素C C发酵微生物的功能关系发酵微生物的功能关系GluVc现况：维生素现况：维生素C两步发酵工艺两步发酵工艺小菌单独培养生长、产酸困难小菌单独培养生长、产酸困难大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸大菌本身不产酸，促进小菌生长和产酸团队承担的国家团队承担的国家863重重点项目和国家支撑项目点项目和国家支撑项目与南开大学功能基因组与南开大学功能基因组学中心、国内最大学中心、国内最大Vc生生产企业合作产企业合作实现组学技术解决发酵实现组学技术解决发酵工业长期问题的典型工业长期问题的典型31基因组测序步骤鸟枪法测序鸟枪法测序提取基因提取基因组组DNA打断基因打断基因组组DNA基因文基因文库构建库

27、构建大规模大规模测序测序罗氏罗氏GSFLX高通量基因组测序高通量基因组测序 衔接子衔接子连接连接单链单链DNA与与磁珠结合磁珠结合油滴中油滴中PCR反应反应序列拼接序列拼接测序测序反应反应填补缺口填补缺口基因组注释基因组注释代谢途径分析代谢途径分析小菌测序小菌测序大菌测序大菌测序代谢途径分析代谢途径分析代谢途径分析代谢途径分析从代谢从代谢途径角途径角度解析度解析两菌关两菌关系系32氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析氧化葡萄糖酸杆菌中心代谢途径分析缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，缺失编码琥珀酸盐脱氢酶的基因，柠檬酸循环不完全柠檬酸循环不完全无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶无编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不

28、能通过糖异生生产，不能通过糖异生生产C6G.oxydans基因组含编码氧化戊糖磷酸基因组含编码氧化戊糖磷酸途径和途径和D途径的全部酶基因途径的全部酶基因缺失编码磷酸缺失编码磷酸果糖激酶的基果糖激酶的基因，糖酵解途因，糖酵解途径不完全径不完全33蛋白质组学蛋白质组学小菌单独发酵时小菌单独发酵时胞内蛋白表达胞内蛋白表达大菌存在时小菌大菌存在时小菌胞内蛋白表达胞内蛋白表达功能蛋白确定功能蛋白确定，研究大菌影，研究大菌影响小菌产酸的响小菌产酸的机制机制K. VulgarB. megaterium34发酵发酵优化优化提高糖酸转化率提高糖酸转化率提高提高VC产量产量提高生产强度提高生产强度基因基因测序测序

29、功能功能蛋白蛋白产物产物解析解析3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖TCA循环循环大菌特定的代谢途径大菌特定的代谢途径L-山梨酮山梨酮2-酮基酮基-L-古龙古龙酸酸L-山梨糖山梨糖2-酮基酮基-L-古龙酸生产途径古龙酸生产途径Vc目标目标1：确定微生物之间的功能关系，提高效能：确定微生物之间的功能关系，提高效能目标目标2：构建：构建Vc一步发酵菌株，实现重大创新一步发酵菌株，实现重大创新举例举例2 2：维生素维生素C C发酵微生物的功能优化与调控发酵微生物的功能优化与调控35棉织物化学前处理工艺棉织物化学前处理工艺SingeingDesizing ScouringBleaching

30、退浆退浆 淀粉、淀粉、PVA精练精练角质、果胶角质、果胶漂白漂白H2O2化学品化学品/ /高温高温化学品化学品/ /高温高温化学品化学品/ /高温高温四种酶发酵四种酶发酵与应用的系与应用的系统控制优化统控制优化效果：效果：提高质量提高质量 节省能源节省能源 减少排放减少排放国内外：加国内外：加酶处理工艺酶处理工艺本课题：本课题：全生物处全生物处理工艺理工艺效益：效益：发酵产值发酵产值5亿亿节能能耗节能能耗15亿亿环境效益环境效益30亿亿举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术SingeingDesizing ScouringBleaching退浆退浆 淀粉、淀粉

31、、PVA精练精练角质、果胶角质、果胶漂白漂白H2O2淀粉酶淀粉酶/PVA/PVA酶酶角质酶角质酶/ /果胶酶果胶酶过氧化氢酶过氧化氢酶棉织物生物前处理工艺棉织物生物前处理工艺36高产菌株选育高产菌株选育产酶微生物筛选产酶微生物筛选菌株鉴定和遗传改造菌株鉴定和遗传改造分子克隆和工程菌构建分子克隆和工程菌构建发酵过程研究发酵过程研究酶的分离与纯化酶的分离与纯化培养基和条件确定培养基和条件确定发酵过程优化策略发酵过程优化策略过程放大和工业化过程放大和工业化分段控制分段控制流加发酵流加发酵低成本低成本放大技术放大技术分离与纯化方法分离与纯化方法酶的基本性质酶的基本性质工业化提取技术工业化提取技术诱导胁

32、迫诱导胁迫举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术37酶制剂应用酶制剂应用酶应用特性和作用机理酶应用特性和作用机理复合酶和酶组分复配复合酶和酶组分复配过程模拟和最佳条件过程模拟和最佳条件应用效果评价应用效果评价应用效果比较研究应用效果比较研究经济学评价经济学评价环境效益分析环境效益分析举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术38野生菌筛选与发酵野生菌筛选与发酵提取高纯度天然蛋白提取高纯度天然蛋白电泳电泳主要斑点主要斑点N端测序端测序或肽指纹术分析或肽指纹术分析N端序列端序列/肽段分肽段分子量数据库查询子量数据库查询获得基因获得基因

33、N端测序端测序设计核苷酸探针杂交设计核苷酸探针杂交获得基因获得基因生物数据库查询生物数据库查询同源序列同源序列保守序列分析保守序列分析设计引物扩增设计引物扩增相关序列片断相关序列片断获得基因获得基因若出发菌基因组序列为若出发菌基因组序列为已知已知若出发菌基因组序列若出发菌基因组序列未知未知Thermobifida fusca 角质酶角质酶角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建细菌来源角质酶编码基因目前在国细菌来源角质酶编码基因目前在国内外未有报道内外未有报道 酶制剂基因鉴定流程酶制剂基因鉴定流程举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术39Purification

34、stepTotal protein (mg)Total activity (U)Specific activity (U/mg)Purification foldYield (%)Crude enzyme234.9 1229452.34 1 100 (NH4)2SO4 fractionation46.4 5205.2112.182.1442.34Phenyl HPSepharose FF4.75 1521.24320.266.1212.37DEAE Sepharose FF2.86 1140.91398.607.619.28Table I Summary of purification of

35、wild-type cutinase from T. fusca天然嗜热子囊菌角质酶的纯化天然嗜热子囊菌角质酶的纯化通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳通过硫酸铵沉淀、疏水色谱、阴离子交换色谱从嗜热子囊菌发酵液中分离纯化得到电泳纯天然角质酶纯天然角质酶角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术40肽指纹图谱鉴定角质酶基因肽指纹图谱鉴定角质酶基因对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因对电泳纯天然角质酶进行肽指纹图谱分析，通过数据库比对，得到角质酶的编码基因

36、(Tfu_0883)角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术41Tfu 0883/pET-20b(+)4558 bpbla (A p) sequenceCutinaseHis tagT7 promoterC olE1 pBR322 originf1 originT7 terminatorpelB sequenceBamHI (199)NcoI (1063)Tfu_0883的克隆、表达和纯化的克隆、表达和纯化通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程菌发酵液酶活达通过基因工程手段使角质酶基因在大肠杆菌中高效表达，工程

37、菌发酵液酶活达180 U/mL，是野生菌产酶的，是野生菌产酶的9.4倍。倍。C u tin h y d r o ly sis p r o d u c ts F .so la n i c u tin a se h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin a se (T fu _ 0 8 8 2 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin a se (T fu _ 0 8 8 3 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) H e x a d e c a n o

38、ic a c id 1 5 .9 4 2 .6 2 9 .2 7 2 .0 7 1 0 .9 6 2 .8 9 9 -H e x a d e c e n o ic a c id 0 .1 3 0 .0 2 0 .0 6 0 .0 2 0 .0 9 0 .0 3 O c ta d e c a n o ic a c id 1 4 .9 9 1 .7 1 9 .2 4 3 .0 1 8 .7 7 2 .6 9 9 -O c ta d e c e n o ic a c id 1 .7 4 0 .6 1 0 .9 8 0 .3 6 1 .1 6 0 .7 9 9 ,1 2 -O c ta d e c a

39、 d ie n o ic a c id 1 .0 8 0 .2 3 1 .3 2 0 .3 7 1 .0 6 0 .2 3 1 6 - H y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 .6 5 0 .3 1 5 .6 6 1 .1 4 4 .7 4 0 .5 4 1 0 ， 1 6 - d ih y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 0 .1 8 1 .1 2 8 .2 9 2 .3 5 9 .1 5 0 .9 7 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 -e n o

40、 ic a c id 1 .9 0 0 .3 4 1 .0 3 0 .3 2 1 .5 2 0 .1 2 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 ,1 2 -d ie n o ic a c id 1 .9 8 0 .9 8 9 .1 9 2 .2 5 1 0 .9 1 1 .0 7 9 , 1 0 , 1 8 -tr ih y d r o x y o c ta d e c a n o ic a c id 1 .9 5 0 .4 2 0 .9 9 0 .1 7 1 .7 8 0 .3 5 重组重组 Tfu0883具有角质酶活性具有角质酶活性 pET-20b(+)

41、, pelB as signal peptide, C-terminal His-tag E. coli BL21(DE3)Rossetta Ammonia sulfate precipitation, Ni-column角质酶高产菌的构建角质酶高产菌的构建举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术42调控调控PGL发酵过程中底物甘油发酵过程中底物甘油的浓度和诱导物甲醇的浓度，的浓度和诱导物甲醇的浓度，实现实现PGL的高产量和高生产强的高产量和高生产强度度图2-3 甲醇和菌体浓度的比值对PGL产量、生产强度和单位细胞生产PGL的能力的影响 PGL/100 PGL

42、productivity PGL production per cell1000前期研究结果举例：前期研究结果举例：甲醇和菌体浓度比值的影响甲醇和菌体浓度比值的影响底物流加研究目标底物流加研究目标流加策略流加策略甲醇流加：控制甲醇流甲醇流加：控制甲醇流 速，将速，将甲醇和菌体浓度比值维持在甲醇和菌体浓度比值维持在0.165 g/g左右左右 甘油流加：细胞快速生长，达甘油流加：细胞快速生长，达高密度；高密度；重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术43菌

43、体生长阶段的甘油流加策略菌体生长阶段的甘油流加策略010 20 30 40 50 60 7002040608010002004006008001000DO (%)时间 (h)搅拌速率 (r/min) B010 20 30 40 50 60 70020406080100120140160020406080100DCW, 甘油 (g/L)时间 (h)流加速率 (mL/h) A 细胞干重在细胞干重在63 h 达达到到122 g/L细胞干重在细胞干重在33 h达达到到140 g/L0510 15 20 25 30 3502040608010002004006008001000DO (%)时间 (h)搅

44、拌速率 (r/min) B0510 15 20 25 30 35020406080100120140160020406080100120DCW, 甘油 (g/L)时间 (h)流加速率 (mL/h) A重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术44诱导阶段的甲醇流加策略诱导阶段的甲醇流加策略 0244872961200100200300400500010203040506070DCW, 甲醇 (g/L), PGL (U/mL)时间 (h) DO (%),

45、F (mL/h), qs (g/g DCW/h)图2-6 甲醇流加控制下的发酵过程曲线 DCW PGL Methanol Feeding rate - - - qs1000 DO诱导前期诱导前期(08 h)以以2 ml/h的速的速 度逐步提高甲醇流加速度，使度逐步提高甲醇流加速度，使 培养液中甲醇浓度接近培养液中甲醇浓度接近20 g/L；(2) 诱导中期诱导中期(890 h)将甲醇流加将甲醇流加 速度控制在速度控制在9.7 mL/h以维持体以维持体 系中甲醇浓度为系中甲醇浓度为20 g/L； 诱导后期诱导后期(90 h以后以后)，DO上升，上升， 将流速维持在将流速维持在2 mL/h。成功将甲

46、醇与菌体浓度比例控制成功将甲醇与菌体浓度比例控制0.1630.171 g/g。发酵结束时。发酵结束时PGL酶活达到酶活达到430 U/mL，生产强度达到，生产强度达到4.34 U/mL/h。 重组重组P. pastoris高密度发酵生产高密度发酵生产PGL的底物流加策略和温度诱导的底物流加策略和温度诱导举例举例3：染整关键酶制剂的发酵与应用技术染整关键酶制剂的发酵与应用技术45举例举例4 4：透明质酸发酵过程优化与控制：透明质酸发酵过程优化与控制透明质酸三级结构透明质酸三级结构优良理化性质：粘弹性优良理化性质：粘弹性 高保湿性高保湿性 生物相容性生物相容性 食品添加剂食品添加剂关节炎治疗关节炎

47、治疗化妆美容化妆美容高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈乳酸对细胞生长和乳酸对细胞生长和HA合成有着较强的抑制作用合成有着较强的抑制作用细胞生长和细胞生长和HA合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争合成之间存在对碳源和关键辅因子的竞争HA发发酵存在酵存在问题问题46透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究透明质酸发酵过程的混合与传质特性优化研究问题问题()()高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈溶氧溶氧水平水平表观表观黏度黏度有效搅有效搅拌区域拌区域体积体积溶氧传溶氧传递系数递系数0nK322

48、21.36cofDPN DDr350.001opPNNDr(%)100cafTVT有效搅拌区域模型有效搅拌区域模型051015200200400600Culture time (h)Agitation speed (rpm)051015200100200300400500Culture time (h)Broth viscosity (mPas)051015200204060Culture time (h)KLa (h-1)051015200306090120120Culture time (h)DO level (%)(a)(b)(c)(d)有效搅拌区域控制模型的混合与传质动力学有效搅拌区域

49、控制模型的混合与传质动力学(Va=1）剪切力对菌体形态影响剪切力对菌体形态影响理想理想HAHA发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧发酵模式：低剪切、高传质、高溶氧47降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率降解透明质酸提高发酵过程的混合及传质效率问题问题()()高粘度和低溶氧传递速率是高粘度和低溶氧传递速率是HA发酵过程的重要瓶颈发酵过程的重要瓶颈酶法降解酶法降解HA提高混提高混合与传质效率合与传质效率氧化还原降解氧化还原降解HA提高混合与传质效率提高混合与传质效率FT-IR分析结果分析结果过氧化氢过氧化氢/抗坏血酸氧化还原降解抗坏血酸氧化还原降解HA 氧化还原氧化还原降解降解HA没没有破坏其有破

50、坏其基本结构基本结构单元单元05101520051015Culture time (h)Cell concentration (g/L)05101520020406080Culture time (h)Sucrose concentration (g/L)0510152002468Culture time (h)HA concentration (g/L)051015200204060Culture time (h)Lactic acid concentration (g/L)(a)(b)(c)(d)HA氧化还原降解对氧化还原降解对HA发酵的影响发酵的影响添加添加H2O2/ /抗坏血酸对流体力

51、学影响抗坏血酸对流体力学影响48Transglutaminase (TGase, Protein glutamine -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 )举例举例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通过通过 N-(-谷酰胺谷酰胺) 赖氨酸键交联蛋白质赖氨酸键交联蛋白质 催化蛋白质中催化蛋白质中Gln的的-羧酰胺基与伯胺间发羧酰胺基与伯胺间发生转移反应生转移反应 蛋白质脱酰胺作用蛋白质脱酰胺作用 通过形成脂键共价连接蛋白质和脂肪酸的长通过形成脂键共价连接蛋

52、白质和脂肪酸的长链链-羟基羟基 目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质目前唯一商业化并大规模生产的可在蛋白质间形成共价交联的酶制剂间形成共价交联的酶制剂49Activation Mechanism of TransglutaminasePre-Pro-TGaseSecreted from cells folding Pro-TGaseInhibitor (TAPI)InhibitionProtease-inhibitor complexsactivationSerine ProteaseMetalloProteaseTGasePro-region (AAs)+Dongxu Zhang, Jin

53、g Wu, Miao Wang, Guocheng Du, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008 (in press). DIO:10.1021/jf8008519 Dongxu Zhang, Miao Wang, Guocheng Du, Qingxin Zhao, Jing Wu, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, 56 (9): 34033408.TAPI: surfactant protein举例举例5： Transg

54、lutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization50根据该根据该TGase活化模型：在发酵过程的产酶初期活化模型：在发酵过程的产酶初期:*添加添加10 mg/mL的的CTAB，使发酵过程酶活提高，使发酵过程酶活提高21.8 %；*添加添加1000 U/mL的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高的胰蛋白酶，使发酵过程酶活提高31.2 %。举例举例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization51Transglutaminase Fer

55、mentation G lucose G 6P F6P G A P G 3P P E P P yr O A A R 5P H is S er C ys Trp P he Tyr A la Val L eu A sp G ly Lys T hr M et A sn Ile A cC oA C it A K G G lu P ro A rg G ln A m ino acids for other proteins A m ino acids for T G ase H is C ys S er G ly Trp P he Tyr A la Val L eu A sp A sn M et T hr

56、 Lys Ile G ln A rg P ro G lu Determine of culture medium by Analysis of amino acid metabolism using mass balances Amino acid metabolic anylysis of Streptomyces Mobaraense Guoliang Yan, Guocheng Du, Yin Li, Jian Chen, Jianjing Zhong. Process Biochemistry. 2005, 40:963-968. M. Y. Zheng, Guocheng Du, J. Chen. Enzyme and Microbial Technology，2002，31(4):477-481 . Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation. DO1DO2DO2DO1pH1pH2举例举例5： Transglutaminase: Activation M