菌悬液与菌片的制备

1、菌悬液与菌片的制备2.1.1.2.1 适用范围 制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片， 以供消毒剂杀菌试验时使用。2.1.1.2.2 试验器材（1）菌种: 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538、铜绿假单胞菌 ATCC 15442、 大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌 ATCC1023、黑曲霉菌ATCC16404在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验 特殊需要，还可增选其他菌株。（2）有机干扰物：见附录 A。（ 3）磷酸盐缓冲液：见附录 A。 （4）无菌蒸馏水。（ 5）稀释液：见附录 A。（6）细菌培养

2、基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA，胰蛋白胨大豆 肉汤培养基（TSB等，见附录A。（ 7）革兰染色液：见附录 A。（ 8）芽孢染色液：见附录 A。（ 9 ）恒温水浴箱。（ 10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。（12）数字可调移液器（10卩l , 20卩l , 100卩l , 200卩l , 1000卩l ） 及配套用一次性塑料吸头。（13）离心机。（14）电动混合器（15）浊度计。2.1.1.2.3 细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0

3、ml10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37C培养18h24h。用接种 环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37C培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营 养琼脂斜面，于37C培养18h24h,即为第3代培养物。2）取菌种第 3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（ 18h 24h），用5.0ml吸管吸取3.0 ml5.0ml稀释液加入斜面试管内， 反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管 中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细 菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细

4、菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度， 然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在4C冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴（2）细菌芽孢悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5 ml10ml营养 肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37C培养18h24h。用接 种环取第 1 代培养的菌悬液， 划线接种于营养琼脂培养基平板上， 于 37C培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营 养肉汤培养基，于37C培养18h24h,即为第3代培养

5、物。2）用 10.0ml 吸管吸取 5.0 ml10.0ml 第 3 代5代的 18h24h 营 养肉汤培养物， 接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面， 将其摇动使菌 液布满营养琼脂培养基的表面， 再将多余肉汤培养物吸出， 将罗氏瓶 置于37C温箱内，培养5d7d。3）用接种环取菌样少许涂于玻片上， 固定后以改良芽孢染色法染色， 并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达 95% 以上时，即 可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上 述芽孢形成率后再进行以下处理。改良芽孢染色法：用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而 后通过火焰加热将菌固定于玻片上。 将涂片放入平皿内，

6、片上放两 层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放 54C 56C条件下，加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。加0.5%沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢 呈绿色，菌体呈红色。4）罗氏瓶培养物， 用 10.0ml 吸管加 10.0ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以 L 棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内 吸加 5.0ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌 悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5mi n,打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置 45C水浴中24h，使菌自溶 断链,分散

7、成单个芽孢。6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液,清除其中的琼脂凝块。7） 将过滤后的芽孢悬液,置无菌离心管内,以3000 r/min 速度离 心 30min 。弃上清液,加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新 悬浮清洗,先后共 3 遍。8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中, 并加入适量小玻璃珠。9）将芽孢液放于80C水浴中10min （或60C, 30min）,以杀灭残 余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于 4C冰箱中备用。有效使用 期为半年。10）芽孢悬液在使用时,应先进行活菌培养计数。11）怀疑有杂菌污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进 行鉴定。2.1.1.2.4 菌片的制备

8、程序（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根 据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其 特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为10mM 10mm当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将 玻璃试管撞碎，故改用 12mm 直径圆形金属片（厚 0.5mm）。（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：将载体放在含洗涤剂的水中煮沸 30 min ;以自来水洗 净；用蒸馏水煮沸10min ;用蒸馏水漂洗至pH呈中性；晾干、 熨平备用。（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规 定的大小，抽去边缘一周的经

9、纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制 成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤 纸制作。（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经 18h24h培养的斜面培养物，细菌芽孢可使用4C冰箱贮存液。含菌 量约为1X 108cfu/ml5x108cfu/mI ,可使用浊度计调整菌液浓度。 滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内， 逐片滴加菌液。 菌液滴加量每片为10卩I。用10卩I移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液， 并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37C温箱内干燥（约20min30min）,或置室温下自然阴干后再使用。（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5X 105 cfu/ 片5X 106 Cfu/ 片。2.1.1.2.5 注意事项 （1）用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀 释度的估计。 作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告 （如杀菌 试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量） ，必须以活菌培养计数的 实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。（ 2）滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。（3）细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌 在37C干燥过程中，滴度最高可下降1个对数值