探究课题 DNA的粗提取和鉴定

1、探究课题: DNA的粗提取和鉴定 一、课题分析1教学目标（1）初步学会DNA的粗提取和鉴定的方法,领悟该实验的实验原理。（2）如实观察并记录实验现象和结果，培养学生求实、严谨的科学态度。（3）分析实验过程中出现的问题，培养学生分析问题和解决问题的能力。（4）通过分组实验，培养协作意识和合作能力。2背景描述核酸是存在于细胞中的一种酸性物质，因为它呈现酸性，所以叫核酸。核酸是细胞的核心物质，是细胞里最重要的生命大分子之一，是支配生命从诞生到死亡的根源物质，主宰着细胞的新陈代谢，被现代科学称为“生命之源”、“生命之本”。核酸是1868年瑞士医生米歇尔（F.Miescher）发现的。20世纪20-30

2、年代确认自然界核酸有DNA和RNA两类，是由核苷酸组成的。40年代以后实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足的进步。1928年，英国科学家格里菲思（F.Griffith）用肺炎双球菌在小鼠身上进行转化实验，证明被加热杀死的S型细菌中存在一种促成无毒性的R活细菌转化成有毒性的S型细菌的转化因子；1944年，美国科学家（O.Avery）35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质；1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，这是20世纪生物科学最伟大的成就，标志着现代分子生物学的诞生。那么DNA是什么样的物质呢？

3、本实验就是将组织细胞中的DNA提取出来，然后进行观察和鉴定。首先利用渗透原理将组织细胞破裂，释放出其中的DNA，由于DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mOlL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以把主要分布在组织细胞核中的DNA在NaCl溶液中析出来。因DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。由于DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而显现蓝色（溶液呈蓝色），且蓝色的深浅与DNA含量的多少有关。因此，二苯胺可以作为鉴定

4、DNA的试剂。二材料器具鸡血细胞液（每组510mL）；烧杯（100mL，1个， 50mL， 500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管架，试管夹，火柴。蒸馏水，体积分数为95的冷酒精，质量浓度为01gmL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2molL和0015molL的NaCl溶液，二苯胺试剂。三教学建议本实验的重点是通过颜色反应定性地验证生物组织中的DNA成分，让学生学会DNA的粗提取和鉴定的操作方法。难点是领悟该实验的设计思想，培养学生科学的研究态度，提高学生的实验操作能力、

5、观察能力和设计能力。1教学方法根据实验内容，建议教师采用探究性实验和验证性实验相结合的教学方法。在实验时可将学生分成若干个小组，分别选择不同的实验材料，如鸡血、新鲜菜花等，让学生找出该实验理想的实验材料，以充分体现学生为主体性，调动学生的实验兴趣、激发学生的创新意识。2注意事项鸡血、植物组织（菠菜菜叶、菠菜菜花、蒜黄菜花等）材料要新鲜；将鸡血细胞液与蒸馏水混合以后，必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使鸡血细胞快速破裂，以便将鸡血细胞核中的DNA释放；用95%酒精溶液进一步提取含杂质较少的DNA时，95%酒精溶液必须在冰箱中至少放24h，因为使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳；溶解细胞核中的D

6、NA、将含DNA的黏稠物再溶解、提取含杂质较少的DNA时，都要用玻璃棒搅拌，使用时玻璃棒不要碰到烧杯底，要注意各步骤中搅拌的方法；在DNA的鉴定中，所用的二苯胺是一种有毒性的试剂，使用时要注意不能让药液接触到皮肤或身体的其他部位，也不要近距离观察；严格按照规范的方法步骤去操作。3课前准备（1）准备好实验材料：新鲜的鸡血细胞液，新鲜的菜花、菠菜、蒜黄和菠菜等。鸡血细胞液是由活鸡的鲜血经沉淀后获得。每组（2 个学生）需用5ml鸡血细胞液，每班（50）至少130mL，鸡血细胞液与鸡血的体积比为13，这样每班至少需要390 mL鸡血细胞液。宰杀1只中等大小的活鸡，一般可得120 mL左右的鲜血，因此一

7、个班需要买4只活鸡。如果不具备购买活鸡的条件，可带放有抗凝剂的烧杯去市场售活鸡处索取鸡血。准备好实验盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器（塑料烧杯和试管）。因为鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，使本来从细胞内提取的含量较少的DNA显得含量更少，这样就会大大影响该实验的效果。因此，为减少提取过程中DNA的损失，该实验最好不用玻璃容器。（2）制备鸡血细胞液的方法：将质量浓度为0.1gmL的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。也可以用离心机离心2 min（转

8、速1000转/分）。用吸管吸去上清液（如图）。2配制二苯胺试剂A液：1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态，则需加温后待其溶化，再使用。液：乙醛的体积分数为0.2%的溶液。配制：将0.1mL液加入到10mL A液中，现配现用。（3）让学生课前预习实验原理。四探究活动步骤之一 创设探究活动情景1提出问题：为什么DNA是主要的遗传物质？ 2质疑：DNA是什么样的物质呢？通过怎样的实验可以将它从细胞中提取出来，然后进行观察和鉴定呢？步骤之二 实施探究活动方案1实验材料的探究质疑：应该怎样选择实验材料？实验材料选择时应该考虑的因素有：要容易取得、细

9、胞分散或容易分散、细胞容易破裂或容易研碎、细胞核中的DNA容易释放等这样的材料。如动物血组织、植物的新鲜菜花等。（说明：因为时间关系，课堂上可以统一用新鲜鸡血作为材料，新鲜菜花、菠菜、蒜黄、洋葱、新鲜豌豆、大白菜等其他材料的探究实验可放在课后作为研究性学习课题进行研究。）2实验过程探究（教师边巡视，边指导）包括对实验步骤的探究，思考实验各操作步骤的原因，学生实验操作时出现问题的解决，提出实验改进措施，总结实验得失情况。在实验进行过程中，要让学生思考每一操作步骤应达到的目的。探究1：怎样提取细胞核物质？（新鲜鸡血细胞液已在课前配好）将制备好的510mL，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水2

10、0mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液（如图）。让学生想一想：证明DNA是遗传物质的实验有哪些？请学生想一想：你能回答该实验的原理吗？让学生讨论：实验材料选择时应考虑哪些因素？让学生思考：制备鸡血细胞液时，加入柠檬酸钠的作用是什么？ 让学生思考：加蒸馏水的目的是什么？加入蒸馏水后细胞将会怎样？让学生思考：为什么用纱布过滤？怎样操作？过滤后留在纱布上的物质主要有哪些？探究2：怎样使核物质DNA溶解？将物质的量浓度为2molL的NaCl溶液40 mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在

11、溶液中呈溶解状态。探究3：怎样使溶解的DNA析出？沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。然后用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL的烧杯中。取纱布上的黏稠物（如图）。让学生思考：核物质DNA溶解的原理？让学生思考：加蒸馏水时千万不能太快太猛的原因是什么？让学生想一想：加蒸馏水的目的是什么？与探究1实验加蒸馏水的目的相同吗？让学生说一说：DNA被析出的原因。让学生观察：滤取出来的黏稠物的颜色。并分析有的同学提取的黏稠物较少的可能原因？让学生思考：过滤时放多层纱布

12、的目的是什么？留在纱布上的黏稠物质主要是什么？探究4：将DNA的黏稠物再溶解，然后过滤取滤液。取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2molL的NaCl溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液（DNA溶于滤液中）。实验探究5：怎样提取含杂质较少的DNA？在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95的冷酒精溶液50 mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继

13、续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。实验探究6：怎样对DNA进行鉴定？取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0015molL的NaCl溶液5mL，将丝状物溶解。然后放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二让学生想一想：这一步骤的目的是什么？让学生想一想：纱布上有什么物质？滤液中有什么物质。说明：将黏稠物再溶解时一定要充分，多搅拌。以免有DNA损失。让学生说一说：提取含杂质较少DNA的原理。让学生注意搅拌方法！让学生观察：丝状物的颜色。让学生思考：丝状物的粗细表示一个DNA分子的直径大小吗？让学生说说：DNA鉴

14、定原理苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。说明：使用二苯胺时要注意不要接触到药液。进行沸水浴时，在实验室较为通风的地方集体进行。让学生根据观察到的试管内溶液颜色的变化情况，说明原因。五讨论与思考1 从鸡血细胞核中提取的物质是DNA吗？简析：在鸡血细胞中加入蒸馏水，并且搅拌，利用渗透作用原理使鸡血细胞破裂，搅拌进一步促进了鸡血细胞的破裂，于是释放出其中的DNA，当然也有少量的RNA，还的蛋白质。因此，释放出的物质是DNA、RNA和蛋白质的混合物，不仅仅只有DNA。2怎样提高血细胞因低渗而破裂的效率？简析：血细胞的细胞膜对低渗溶液

15、有一定的抵抗能力，这在生理学上称为渗透脆性。一般而言，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度的低渗环境之中，细胞因大量失水而致最终破裂并释放出胞内物（包括细胞核）。为促进细胞在低渗条件下破裂，可以辅以快速而有力的搅拌，使之受机械震荡而更易破裂。3怎样才能把血细胞释放的DNA滤入收集的滤液中？简析：这一步较难处理，在过滤过程中常常发生因粘稠的果胨样物质堵塞过滤纱布的网眼而使后续的过滤难以完成，很多DNA没能滤入滤液中，这是造成失败的主要原因之一。解决的方法有：（1）过滤时待过滤溶液倒入漏斗的速度应缓慢，以免沉积于溶液中层的胶状物一下就把纱布堵住，使过滤不能完成；（2）一旦出现大量胶状物使过滤不能

16、进行下去，切忌用力挤压而使胶状物也滤入滤液之中，可以把胶状物重新用适量的2mol NaCl溶液进行搅拌，使其中的DNA得到溶解，然后再进行过滤。4怎样使DNA低渗析出时能形成易收集的粘稠物？简析：常见的做法有（1）使用足够容量的烧杯盛好蒸馏水后沿杯壁缓缓加入，切忌快速迅猛倒入时把形成的粘稠物冲散；（2）加水之初玻璃棒可不搅拌，随后玻棒搅拌的速度一定要缓慢（几秒钟绕500mL烧杯内侧壁一圈），同时观察杯内粘稠物是否能设法绕到玻璃上；（3）一旦有很多粘稠物不能被绕到玻璃上，对较大的粘稠物可滴管分别吸取，对大量细小分散的粘稠物可通过离心或过滤等方法收集到。一般能在玻璃上直接缠绕溶液中形成的呈粘稠物样

17、的DNA，就不需要如教材上所讲的那样通过过滤才收集到析出的DNA。 3实验中看到的丝状物的粗细是不是DNA分子的直径呢？简析：不是。因为DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA分子聚在一起形成的。4用95的冷酒精提取含杂质较少的DNA的原因是什么？简析：用95的冷酒精的目的是因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出，悬浮于溶液中。5在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将提取获得的含DNA的黏稠物（还含有较多杂质）分别处理如下： （ ）（1）放入0.14mol/L的NaCI溶液中，搅拌后过滤，得滤液A和黏稠物a。（2）放入2mol/L的NaCI溶液

18、中，搅拌后过滤，得滤液B和黏稠物b。（3）放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液C和黏稠物c。以上过程获得的滤液和黏稠物中，含DNA少的是 AAbC BABc CaBCDAbc答案：A六深化拓展1用洋葱如何做DNA粗提取与鉴定实验？方法介绍：在做“DNA的粗提取与鉴定”这个实验中，通常所选取的实验材料是鸡血细胞。用鸡血细胞做实验材料时存在实验操作步骤繁锁，实验过程中较难观察到黏稠物出现，在析出DNA黏稠物时，很难估计加入蒸馏水的量。因此，为了避免出现上述问题，在实验中，选用洋葱作实验材料，实验效果显著。（1）实验原理细胞有两层脂质膜，细胞膜和核膜（植物细胞还具有细胞壁），洗涤剂可以溶

19、解细胞的细胞壁，去除脂质和蛋白质。在溶液中，DNA链略带负电荷，而盐离子可被吸引到DNA的负电荷上，中和这些负电荷，只要控制盐的浓度，就能够使DNA片段或者散开，或者聚合在一起，因此，食盐能够保持溶液中的浓度与细胞液相当。DNA不溶于酒精，但细胞中的某些物质可以溶于酒精。利用这一原理，就可以用酒精萃取DNA。DNA与二苯胺作用生成蓝色沉淀，即可观察到。（2）材料用具洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵（家用豆浆机）、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒（10mL一支）、滴管、试管（20mL二支）、天平。蒸馏水、体积分数为95的冷酒精、0015molL的NaCl溶液、二苯胺试剂。（3）方法步骤准

20、备材料足量的洋葱，普通型（非浓缩型）餐具洗涤剂，食盐；配制二苯胺试剂：4g二苯胺溶于400mL冰醋酸中，再加11mL浓硫酸（比重1.84）,若冰醋酸不纯，试剂呈蓝色或绿色，则不能使用；配制0015molL的NaCl溶液：称取0.88gNaCl，投入1000mL容量瓶中，加水到所需体积的刻度线上，溶解后成0015molL的NaCl溶液。实验操作称取10g洋葱鳞片叶，剁碎后放入研钵中，再往该研钵中加入0.5gNaCl和1mL洗涤剂，作圆周状充分研磨。将混合液用滤纸或二层纱布过滤，将滤液收集到一支试管中澄清。将澄清液转入1支干净的试管中，再往该试管内加入等量冷却的（事先经冰箱通过5以下低温处理24h

21、）体积为95%酒精。由于DNA不溶于酒精，轻轻摇动试管，就会在溶液中出现白色“毛絮状”物，这些白色“毛絮状”物即为DNA。用表面粗糙竹筷代替玻璃棒，沿着一个方向卷起“毛絮状”物DNA。取两支试管，分别编号为1号、2号，各加入0015molL的NaCl溶液，将所得到的白色“絮状”物放入1号试管，搅拌使其溶解，然后向两支试管中分别加入4mL二苯胺试剂，混合均匀后，在沸水中加热510min，观察颜色的变化。 实验注意事项 材料必须充分搅碎成糊状，否则洋葱细胞没有彼此分离，影响实验效果；加入酒精后摇动或搅拌时一定要轻缓，否则会破坏DNA，以至于看不到；进行DNA鉴定，二苯胺最好现配现用，否则二苯胺会变

22、成浅蓝色，影响鉴定结果。该实验虽然没有涉及DNA在氯化钠溶液中的溶解特性，但教学大纲中也没有要求。用此实验让中学生进行生物学界最前沿的实验，使学生能简单方便、快速成功地提取到DNA，以增强学生的感性认识，所以，是可以采用的。（郑光美主编 生物学通报 2002年 第10期 第4647页；生物学通报 2003年 第4期 第24页）2用新鲜菜花如何做DNA粗提取与鉴定实验？方法介绍：（1）材料用具新鲜菜花（或蒜黄、菠菜）。塑料烧杯，量筒玻璃棒，尼龙纱布，陶瓷研钵，试管，试管架，试管夹，漏斗，酒精灯，石棉网，三角架，火柴，刀片，天平。研磨液，体积分数为95的酒精溶液，二苯胺试剂，蒸馏水。（2）方法步聚DNA粗提取准备材料：将新鲜菜花和体积分数为95的酒精溶液放入冷箱冷冻室，至少24小时。取材：称取30g菜花放入，去梗取花，切碎。研磨：将碎花放入研钵中，倒入10ml研磨液，充分研磨10 min。（注：研磨一定要充分！）过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液滤入烧杯中（有条的学校可将滤液倒入塑