北京大学深圳临床医学院-深圳第二人民医院

1、深圳大学第一附属医院教案首页第 次课，授课时间2012 年 01月09 日，教案时间2011年09月3日课程名称实验诊断学年级2009专业层次本科生授课方式大课讲授学时2教研室实验诊断学科室检验科教具多媒体教员李卓成专业技术职务主任技师电话2211授课题目（章、节）第九章临床病原体检测基本教材1. 诊断学第七版，陈文彬，潘祥林主编，人民卫生出版社参考书目2. 临床免疫学与检验第四版，人民卫生出版社3. 实验诊断学 ，北京医科大学出版社教学目的与要求1. 掌握感染性疾病的诊断和治疗原则2. 熟悉标本的采集、运送和常见病原体感染的检测3. 了解病原体耐药性和机制大体内容与时间安排，教学方法1. 教

2、材内容比较丰富，希望同学课前能预习和课后复习教材内容。2. 具体内容及时间安排，见教案。上课时内容将有删减。3. 教学时将采用多媒体，并进行临床举例及必要时提问。教学重点，难点重点： 1、病原体的检查方法2、病原体耐药性产生机制3、感染性疾病的病原体类型难点：1、病原体测定的各种标记物临床意义2、病原体测定的各种方法外语关键词（每学时10 个）ESBL, MIC, E-test， AST学员学习方法1. 要求学员以教材内容为主进行预、复习。2. 主要要求掌握内容能在课时即掌握。3. 有兴趣的同学可进行必要的课外学习，完成综述或科研设想的写作，作为平时成绩的考核结果。教案续页1辅助手段基本内容时

3、间分配检查目的：确定感染的发生和性质，在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预防措施，防止感染传播造成的危害。第一节标本的采集运送、实验室评价和检查方法一、标本的采集和运送标本采集的基本原则：根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位，尽量采集病变明显部位标本。在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素使用前（如使用过抗生素应在申请单上注明） 。采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、立即送检。标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。（一） 血液适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人。一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。24小时内采血 23次可提高阳性率。血液与培养基的比例

4、为 1： 10，一般成人血量 1020ml ，婴儿 1-5ml 。幻灯（二）尿液图 1无菌采集中段尿如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。排尿困难者考虑导尿采集标本。（三）粪便挑取脓、血或粘液部分。排便困难者，采用直肠拭子采集。怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨或卡-布运送培养液送检。幻灯传染性腹泻应连续送检 3次。图 2（四）呼吸道标本鼻咽拭、痰和经气管采集的标本上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予注意(五 )脑脊液与其他无菌体液脑脊液： 腰椎穿刺， 抽取 2-3ml ，置于无菌容器中立即送检，不能暂时保存于冰箱中。胸腹水等穿刺液标本：分别置于抗凝与不

5、抗凝无菌容器中立即送检。怀疑厌氧菌感染，采用床边接种为宜。（六）眼、耳部标本用拭子采样，鼓膜穿刺亦可用于新生儿和老年人。（七）泌尿生殖道标本2根据不同疾病的特征及检验项目采集不同的标本男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。女性：用无菌棉纤采集阴道或宫颈分泌物。怀疑厌氧菌感染，应采用阴道后穹隆穿刺法，并立即接种于厌氧平板。（八）创伤、组织和脓肿标本开放性脓肿及脓性分泌物：用无菌棉纤采取脓液或病灶深部分泌物，置于斯氏运送培养基送检。封闭性脓肿：局部消毒后，用注射器抽取，怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气采集。大面积烧伤的创面分泌物：用无菌棉纤多点采取脓液或分泌物，置于无菌试管中送检。（九）血清用于检测患者

6、特异性抗体效价以辅助诊断感染性疾病。二、标本的实验室质量评估标准实验室必须遵循一套严格的标本接收和拒收准则1.标本必须注明姓名、年龄、性别、采集日期、临床诊断、检验项目等基本信息，并有病程及治疗情况的说明。无标签的标本，不接收。2.仔细核对标本的采集日期和送检日期。3.检查送检容器是否完整，有无破损或渗漏等情况，若有则不予接收。4.标本储存、运送方式不当，不予接收。5.明显被污染的标本不予接收。6.标本量明显不足的标本，不予接收。7.同一天申请做同一实验的重复送检标本（血培养除外），不予接收。8.对于烈性传染性标本的采集和运送应严格执行相关规定。例外情况：取材特别困难、储存运送条件简陋等。三、

7、检查方法（一）直接显微镜检查幻灯染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。图 3评价：为临床初步诊断提供依据。如CSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染。不染色标本：用于观察病原体的大小、形态与运动等特性。结果评价：部分病原体可借此初步诊断，如暗视野显微镜下见弹簧状螺旋体，应怀疑梅毒螺旋体的感染。(二 )病原体特异性抗原检测用已知抗体检测患者血清和其他体液中待测抗原，借助免疫荧光技术、酶联免疫技术等检测标本中未知的病原体抗原，其诊断价值常以标本不同而异。（三）病原体核酸的检测技术主要有 PCR和核算探针杂交技术3检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。

8、阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。（四）病原体的分离培养与鉴定。明确感染病原体，并为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。1.细菌感染性疾病病原体的分离培养微生物检验中确诊的关键步骤2.不能人工培养的病原体感染性疾病将标本接种易感动物、鸡胚或行细胞培养。（五）血清学实验特异性 IgM 作为感染性疾病的早期诊断指标，区分原发与复发感染。特异性IgG ，尤其双份血清的滴度呈4倍或 4倍以上升高，考虑病原体感染。排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确感染的病原体。第二节病原体耐药性检测一、耐药性及其发生机制（一）耐药病原体革兰阴性菌居多，约占 60% ，主要是铜绿假单

9、胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌以及肠杆菌属细菌等。1. -内酰胺酶介导的耐-内酰胺类抗生素的革兰阴性菌2.质粒介导的产超广谱-内酰胺酶（ ESBL ）的 ECO,KPN3.染色体编码产生类-内酰胺酶的 ECL,EAE4.多重耐药的铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌和不动杆菌革兰阳性菌，约占 30%，以葡萄球菌和肠球菌为主1.耐甲氧西林葡萄球菌（MRS ）2.耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）3.耐万古霉素肠球菌（VRE ）4.高耐氨基糖苷类抗生素肠球菌病毒也出现了耐药病毒株：如HBV 发生突变（二）耐药机制1.细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统2.产生灭火酶和钝化酶( -内酰胺酶 )3. 药物作用靶位点

10、改变：抗生素结合蛋白发生改变（PBP）4. 细胞外膜通透性改变（减少或突变）5. 细菌膜外排泵出系统二、检查项目、结果和临床应用（一）药物敏感试验抗微生物药物敏感试验(antimicrobialsusceptibilitytest, AST)体外检测抗菌药物抑制或杀灭细菌的能力， 亦即是检测细菌对抗菌药物敏感性 (或耐药性 )，以指导临床选择治疗药物。幻灯图 441.K-B 纸片扩散法 :WHO 推荐的标准纸片扩散法药敏试验结果与临床抗生素剂量关系敏感 (S) 测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。中介 (I) 测试菌能被测定药物大剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑

11、制。幻灯耐药 (R) 表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的图 5血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。2.稀释法（ dilution test ）分为肉汤稀释法和琼脂稀释法，结果按敏感和耐药报告。最低抑菌浓度（MIC ）：能够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度。3.E test是结合稀释法和扩散法原理和特点而设计的一种方法。4.耐药筛选试验以单一药物、单一药物浓度检测细菌的耐药性，常用于对耐甲氧西林葡幻灯萄球菌等。图 65.折点敏感试验仅用特定抗生素浓度而不使用测定 MIC 时所用系列抗生素浓度测试细菌对药物的敏感性。（二）耐药菌检测试验1.耐甲氧西

12、林葡萄球菌（MRS ）的筛选测定用添加有 4%NaCl 和 6g苯唑西林 /ml 培养基的 M-H 琼脂进行筛选测定。意义： MRS 对全部 -内酰胺类抗菌药物,包括青霉素和头孢菌素以及其他抗菌药物均耐药，仅糖肽类抗生素有效。2.氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌的筛选测定采用纸片扩散法和肉汤稀释法，对庆大霉素纸片（ 120g/ml ）的抑菌直径 6mm时可判为耐药。3.耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)的筛选测定可采用 1g苯唑西林纸片琼脂扩散法，抑菌圈直径 <19mm 且MIC>2 g/ml应视为耐青霉素肺炎链球菌。意义： PRSP对氨苄西林、氨苄西林 /舒巴坦、头孢克肟、头孢唑啉的临床

13、治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。4.-内酰胺酶的检测-内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构 -内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。常用的检测方法有产色头孢菌素法和碘-淀粉测定法。临床意义：（ 1）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，5表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。（2）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药。5.超广谱 -内酰胺酶 (extend spectum -lactamase, ESBL) 检测超广谱 -内酰胺酶是由质粒介导的 -内酰

14、胺酶，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要在大肠埃希菌和克雷伯菌属等肠杆菌科细菌中产生。检测方法包括双纸片扩散法、三相试验和E实验，其中双纸片扩散法是临床较常开展的项目幻灯产 ESBL 细菌 ,不论体外药物敏感试验结果如何, 对青霉素类、头孢菌素图 7类和氨曲南治疗均无效。（三）病原体耐药基因的测定分子生物学技术： PCR法、 PCR-RFLP 分析、 PCR-SSCP分析、生物芯片技术和自动测序技术意义：比培养法更早检测出病原菌的耐药性对病原菌的耐药性具有确诊意义比常规方法检测病原菌的耐药谱更准确可作为考核其他耐药性检测方法的金标准第三节临床常见病原体检查感染性疾病指各种病原体（病原微生物

15、、寄生虫）寄生人体所引起的传染性疾病和非传染性感染疾病。一、流行病学和临床类型（一）流行病学1.病谱发生变迁，新传染病陆续被发现：嗜肺军团菌，SARS 冠状病毒2.多重耐药株的出现，导致抗感染治疗的困难3.医院感染及条件性致病菌感染的增加（二）临床类型临床常见病原体为：细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体以及寄生虫等。细菌感染仍然是发病率较高的感染性疾病二、检查项目和临床应用（一）细菌感染普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。流行病学调查：病原体抗体检测，如Widal 反应等。（二）

16、病毒感染细胞培养快速复制的病毒：细胞培养。细胞培养不能快速复制的病毒：目前多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸，如 CMV 。6不能细胞培养的病毒：病毒核酸检测与病毒特异性抗体检测，如HCV 、HPV 等。（三）真菌感染直接显微镜检查：初步明确真菌感染。分离培养：明确何种真菌感染。真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织幻灯胞浆菌等。图 8真菌抗体检测：深部真菌的检测。（四）寄生虫感染直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。寄生虫抗体检测：辅助诊断。幻灯（五）其他病原体感染图 91.支原体检测分离培养：阳性可明确诊断。目前临床多检测支原体抗原与核酸，用于早期快速诊断2.螺旋体检测直接显微镜检查有初步诊断价值。幻灯特异性抗体的检测为确诊依据。图 103.立克次体检测外斐试验为非特异性血清学诊断试验4.衣原体检测直接显微镜检查：检查衣原体包涵体可提供早期初步诊断。分离培养：阳性可明确诊断。目前临床多检测衣原体抗原与核酸，用于早期快速诊断。5.严重急性呼吸道综合征（SARS ）病毒的检测：免疫学方法、基因检测、细胞培养（六）实