心脏缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶的变化(一)

1、心脏缺血再灌注损伤后一氧化氮合酶的变化(一)    作者：唐省三,马亚珍,刘红云,朱晓琴,雷水生【关键词】 再灌注损伤Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperf

2、usion injury (IRI) in rat hearts. METHODS: IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were

3、 determined by Western blot and RTPCR methods respectively. RESULTS: eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level

4、at day 3 after IRI and then decreased to basal level. CONCLUSION: The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion inj

5、ury.【Keywords】reperfusion injury; nitric oxide synthase; heart【摘要】 目的： 研究大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)过程中一氧化氮合酶(NOS) 的变化规律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心脏IRI动物模型,用同位素法测定正常及IRI心组织的NOS活性；用Western印迹和逆转录PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI过程中蛋白和基因表达的变化.结果： 心脏eNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注26 h后均增高，3天后降低，21天后逐渐恢复到正常水平. 心脏iNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注12 h后开

6、始表达，3天达高峰，然后逐渐降至正常水平. 结论： 单纯缺血并不引起NOS 活性的明显变化,再灌注损伤使NOS的mRNA表达增加,酶的合成增多,活性增高.【关键词】再灌注损伤；一氧化氮合酶；心脏0引言一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起着极其重要的作用1.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分为原生型(cNOS) 和诱生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分为神经型(nNOS) 和内皮型(eNOS).心脏组织内的NOS同功酶有两种,即eNOS和iNOS. 参与炎性反应及急性排斥反应等病理过程2. 我们研究eNOS和iNOS在心脏

7、IRI中的变化规律及其作用,为其防治提供理论基础.1材料和方法1.1材料SD大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；iNOS Assay Kit 购自南京建成生物技术研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 购自武汉博士德公司； HRP标记的兔抗羊IgG二抗购自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆转录酶(AMV RT)均为美国Gibco 公司产品；eNOS和iNOS 引物及内参照由上海博亚生物技术公司合成. 冠状动脉阻断再灌注模型制备3后在不同的再灌注时间点处死大鼠,收集心脏标本,液氮急冻, -70保存备用.1.2方法取雄性200220

8、 g SD大鼠120只,随机分为缺血再灌注（IRI）组和假手术（对照,Control）组，每组60只，在再灌注不同时间点（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）处死大鼠，每组每个时间点各5只.统计学处理:数据均以x±s表示. 应用SPSS11.0软件进行方差分析, P0.05为有显著性差异.2结果2.3NOS mRNA的基因表达IRI组心脏再灌注早期(0.512 h) 即可诱导eNOS mRNA表达增强,2 h达高峰,此后随着损伤程度加重,其表达迅速下降. 3 d低于对照组,以后逐步恢复,21 d已相当对照组水平. 在对照组心脏iN

9、OS mRNA表达微弱,再灌注12 h后开始增强,3 d达高峰,21 d恢复正常水平(Fig 2, Tab 3) .以上eNOS和iNOS mRNA的消长变化与蛋白质的表达和酶活力的变化一致.表3大鼠心脏IRI后eNOS和iNOS mRNA半定量结果(略)3讨论eNOS来源的NO具有舒张心血管,抑制白细胞浸润和血小板的凝聚作用5，从而对心脏可能起到保护作用. Song等6的研究表明,在早期eNOS的过量表达对小鼠骨骼肌的IRI具有保护作用,随着损伤过程的进展, 心脏结构和功能的损害不断加重,eNOS表达也相应迅速下降.这可能由于大量心肌细胞坏死和凋亡,导致eNOS的合成减少有关. eNOS的表

10、达随着心脏损伤修复和心功能的恢复逐步恢复. NO在心肌再灌注损伤中加重心肌损害. 缺血再灌注情况下,多种细胞因子上调巨噬细胞等内的iNOS的mRNA表达,立即产生大量的iNOS和NO. 过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自由基如过氧亚硝酸阴离子(ONOO),后者可进一步反应生成HO-, NO2, NO3-等,其结果是引起和加重心肌缺血再灌注损伤7.我们发现，单纯缺血1 h对心脏NOS活性无明显影响,再灌注30 min 后NOS活性即开始升高,26 h到达高峰,持续到6 h，此后迅速下降,24 h降低到正常以下,21 d时恢复至正常水平. RTPCR分析发现eNOS及iNOS mRNA的变化与其

11、蛋白变化相一致. 可见在IRI中,早期eNOS的高表达可能参与了早期心血流的调节,对抑制心血管痉挛、减少炎性细胞的浸润有关；iNOS参与介导了心脏IRI的炎症损伤.可以设想,在器官保存过程中或移植后早期使用iNOS 的抑制剂,将会减少急性心肌坏死和凋亡以及急性排斥反应的发生, 对IRI 起到保护作用,促进心功能的恢复，为临床提供科学的理论依据.【参考文献】1 张荣庆，徐凯，程何祥，等. 卡维地洛对缺氧心肌细胞NO生成的影响J. 第四军医大学学报，2002；23（22）：2071-2073.Zhang RQ, Xu K, Cheng HX, et al. Effects of carvedilo

12、l on nitric oxide production by myocardial cells during anoxia J. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23（22）：2071-2073.2 许春梅，董卫国，余保平，等. 低氧诱导因子1及诱导型一氧化氮合酶在炎症性肠病中的表达J. 第四军医大学学报，2004；25（17）：1558-1561.Xu CM, Dong WG, Yu BP, et al. Expression of hypoxiainducible factor 1 alpha(HIF1) and inducible nitric oxide sy

13、nthase(iNOS) genes in inflammatory bowel disease J. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（17）：1558-1561.3 Suzuki M, Sasaki N, Miki T, et al. Role of sarcolemmal K(ATP) channels in cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in mice J. J Clin Invest, 2002;109(4):509-516.4 Cheung F, Siow YL, Chen WZ

14、, et al. Inhibitory effect of Ginkgo blloba extract on the expression of inducible nitric oxide synthase in endothelial cells J. Biochem Pharmacol, 1999;58(10):1665-1673.5 Ozaki M, Kawashima S, Hirase T, et al. Overexpression of endothelial nitric oxide synthase in endothelial cells is protective against ischemiareperfusion injury in mouse skeletal muscle J. Am J Pathol, 2002;160(4):1335-1344.6 Song W, Lu XR, Feng QP. Tumor n