微生物工程及设备复习资料

1、微生物工程复习提纲一、微生物工程概论微生物产品的四大类型：微生物菌体细胞、微生物细胞的代谢产物（初生和次生代谢）、通过微生物细胞转化的类型（药物、激素）、微生物分泌的蛋白和酶类。微生物工程的发展简史1）传统的微生物发酵技术天然发酵2）第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立：1.1680年列文虎克发明显微镜，第一个通过显微镜观察到用肉眼看不见的微生物，包括细菌、酵母等。2.1857年法国人巴斯德发现并证明了酒精发酵是由活酵母引起的，各种不同的发酵产物是由不同的微生物产生的。3.1897年德国的毕希纳进一步证明酶对发酵的作用，为微生物工程奠定了牢固的基础。4.十九世纪初德国人科赫首先发明固体培养基，

2、得到了细菌的纯培养物，由此建立了细菌的纯培养技术。3）近代微生物发酵技术深层培养技术 4）第三代微生物发酵技术微生物工程二、微生物的代谢调节和代谢工程1. 代谢工程基本思路：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作 2.代谢工程的设计：改变代谢途径，扩展代谢途径，转移或构建新的代谢途径。三、菌种的来源与选育1.微生物工程的工业生产水平的决定要素：生产菌种的性能，发酵及提纯工艺条件（发酵工艺的优化和提取工艺的优化），生产设备。其中第一步优良的菌种是最重要的。2.分离纯化、筛选菌种的一般步骤：调查研究（资料查阅） 试验方案设计 标本采集 标本的预处理 富集培养 菌种初筛 菌种复筛 性能

3、鉴定 菌种保藏3.标本预处理常用的方法：物理方法：加热、膜过滤、离心等。化学方法：加碳酸钙提高pH值等。诱饵法：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。预处理的目的：可大大提高菌种分离的效率。富集培养：指给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，从而增加混合菌群中所需菌株的数量，而得以快速分离纯化的目的。四、优良菌种的选育1.优良菌种选育的方法：自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术。2名词解释：自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。诱变育种：利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微

4、生物细胞，提高基因突变变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。杂交育种：将不同菌株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，得到具有新性状的菌株。原生质体融合技术：将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。即实现遗传重组。准性生殖：3常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物，与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基）、生物诱变剂（噬菌体，转座子）。4.诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大培养P53.(选择)5.（大题）诱变育种的基本方法：1）出发菌株选

5、择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。菌株来源是从自然界中分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；已经诱变过的菌株。 其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。2）制备菌悬液：待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞10610

6、7个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。3）诱变处理：诱变剂剂量选择 ：在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。不同微生物，使用的剂量不同；诱变率随诱变剂剂量的增加而提高。但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。诱变剂使用：单一诱变剂处理；复合诱变剂处理 6（大题）原生体的融合技术一般步骤：选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤。（常用的试剂）方法：1）选择亲株：选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别

7、的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 2）原生质体制备：去除细胞壁是制备原生质体的关键。培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。3）原生质体融合：聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合。一般PEG的使用浓度范围在25-40%。采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合。4）原生质体再生：使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最

8、适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压。5）融合重组子的筛选：通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-。7.基因工程技术的主要步骤基因工程技术：将一个含有目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转入一受体细胞（通常多为细菌），使之扩增、表达的操作过程。一般过程方法：含目的基因的DNA片段的准备；载体；含目的基因的DNA片段与载体相连接；将重组分子送入受体细胞，并于其中复制、扩增；筛选出带有重组DNA的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物五、菌种的保藏的方法（原理：P78 选择题）1斜面低温保藏法：将菌

9、株接种于合适斜面培养基上，而后置于4冰箱保藏，每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保藏。这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌种客易产生变异。 2、液体石蜡保藏法：将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达l年以上。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。3、砂土管保藏法：将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器

10、内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。该法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽孢的细菌和酵母菌。主要包括砂土管制备和真空抽干两步。4、真空冷冻干燥保藏法：在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，可长期保存，一般为510年。微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。该法存活率高，变异率低，并能广泛适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是目前广泛采用的好方法

11、。其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。 5、液氮超低温保藏法：适用范围最广的超低温保藏法。其原理是液氮的温度可达-196 ，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（-130 ），此时，菌种的代谢活动停止，化学作用亦随之消失。注意点：安瓿管是否完好、冷冻的速度、液氮的添加6、悬液保藏法：即寡营养保藏，将微生物悬浮在不含养分的溶液中，如蒸馏水等。保藏的关键：试管密封好，以防水分蒸发。7、低温保藏法：多数微生物可在-20 以下的低温中保藏。注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后再冷藏。保藏方法斜面冰箱保藏法 4； 3-6个月沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，1年菌丝速冻法

12、甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 石蜡油封存法 1年左右真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上液氮超低温保藏法 -196；保护剂；保存期长六、培养基1.培养基的类型：根据来源不同，分为：天然培养基：采用化学成分不清楚或化学成分不恒定的各种动植物或微生物的浸出物、水解液等物质制成的。合成培养基：用化学成分和数量完全了解的物质配制而成，成分精确，重复性强，可减少不能控制因素。半合成培养基：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。根据物理性状不同，分为：液体培养基，固体培养基，半固体培养基根据主要成分和使用目的，分为：基础培养基增殖培养基鉴别培养基：培养基中加有能与某一菌的无色代谢物发生显色

13、反应的指示剂。选择培养基：根据某生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。根据生产工艺的要求，分为：孢子培养基，种子培养基，发酵培养基。种子培养基：满足菌种生长用的。营养丰富，氮源、维生素比例较高。发酵培养基：满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养物质。2微生物培养基的成分（常用的种类，作用，类型）：碳源，氮源，无机盐，微量元素，生长因子，促进剂和抑制剂，前体和水。3常用碳源：糖类、脂类、有机酸、低碳醇。糖类：葡萄糖（纯葡萄糖、水解淀粉），乳糖（纯乳糖、乳清粉），淀粉（大麦、花生粉、燕麦粉、黑麦粉、大豆粉等），糖蜜（甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等）脂类如

14、各种植物油和动物油也能被许多微生物用作碳源和能源。有机酸：如乳酸，醋酸，柠檬酸，延胡索酸等3.氮源：分为无机氮源和有机氮源1）无机氮源：种类：铵盐、硝酸盐和氨水。特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。选择合适的无机氮源的意义：满足菌体生长，稳定和调节发酵过程中的pH 2）有机氮源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。如：玉米浆含有可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸；较多的乳

15、酸硫、磷、微量元素等有机氮源成分复杂，可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。使用注意：有机氮源和无机氮源应当混合使用；早期：容易利用易同化的氮源无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质。有些产物会受氮源的诱导和阻遏。4.无机盐：磷酸盐、硫酸镁、钾盐、微量元素（锰、铁）等。来源：C、N源，以盐的形式补充；使用注意点：对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑；使用时注意盐的形式（pH的变化）。5,。名词解释：前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微

16、生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。产物促进剂：那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。抑制剂：可以抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。6.培养基的优化培养基设计与优化的大致步骤：1）根据前人的经验和培养基配制的基本理论，初步确定可能的成分；2）通过单因子实验确定最为适宜的培养基成分；3）通过多因子实验确定各成分的最适浓度正交实验设计步骤：1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安

17、排实验；3）根据正交表给出的实验方案，进行实验；4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。七、发酵工艺的控制1温度对发酵的影响及其控制1）温度对微生物生长的影响生物体的生命活动可以看作是相互连续进行酶反应的表现，任何化学反应又都和温度有关。所以温度直接影响酶反应，从而影响着生物体的生命活动。每种微生物各有其生长发育所需的温度。在最适温度范围内，生长速度随温度升高而增加，发酵温度升高，生长周期就缩短。不同生长阶段的微生物对温度的反应则不同。2）温度对产物形成的影响许多产物的形成速率对温度都很敏感。3）温度影响发酵液的物理性质如温度可影响氧在发酵液中的溶解度，影响基

18、质的分解速率等。从而间接影响了微生物的生物合成。4）温度影响生物合成的方向如金色链丝菌在低于30 时，合成金霉素的能力强，在高于35 时，合成四环素的能力非常强，金霉素的合成几乎停止。2.生物热（名词解释）：生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2和NH3时释放出的大量能量。用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。还与菌体的呼吸强度有对应关系。3.搅拌热（名词解释）：搅拌器的机械搅拌的动能以摩擦放热的方式使热量散发在发酵液中。4.蒸发热（名词解释）：通入发酵罐的空气，其温度

19、和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。5.发酵热（名词解释）：名词解释：生理酸性物质：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺；生理碱性物质：菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。6.pH对发酵的影响：（发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。 它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。因此，必须掌握发酵过程中pH的变

20、化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。尽管多数微生物能在34个pH单位的pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使pH在很窄的范围内保持恒定。）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 7.影响发酵pH的因素1）发酵过程中pH的变化：生长阶段：此时，微生物调节

21、培养基pH的能力惊人，所以培养开始时发酵液pH的影响是不大的。 生成阶段：某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。 自溶阶段： pH上升，发酵后期，pH上升。 2）引起pH下降的因素：碳源过量：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。 消泡剂添加过量。生理酸性物质的存在3）引起pH上升的因素：氮源过多：无机/有机氮源的代谢起到提高pH的作用。生理碱性物质的存在。中间补料，碱性物质添加过多。当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升，是补料的标志之一。8.临界溶氧浓度（名词解释）：CCr指在好氧发酵中，满足微生

22、物呼吸的最低氧浓度。9气液相间的氧传递和传质方程式 稳定状态下，氧分子从气体扩散到液体主体的传递速率为：10.摄氧率(r)（名词解释）：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2·L-1·h-1 。11. r= QO2 .X（X：细胞浓度）呼吸强度（QO2）：用来描述微生物的耗氧速度，指单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2·g菌-1·h-1 12.溶氧浓度控制（溶氧对发酵的影响，对溶氧调节的方法）：1）从供氧方面考虑：从氧传递动力学方程式，可以看出：在供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力（c* - cL)和体积氧传递系数

23、KLa。（1）提高kLa ：kLa 反映了设备的供氧能力，不但与反应器的结构参数有关，还与发酵液的性质有关（粘度、浓度等）搅拌转速：kLa (Pg/V) ×Vs Pg N2.46。可见，提高N可以有效的提高kLa，从而增加发酵液中的溶氧浓度。但是，高转速也有不利的方面（能耗 、菌体对剪切力的要求）。Vs-空气流速：由公式kLa (Pg/V) ×Vs可知，提高Vs即提高通风量Q也可以有效的提高kLa。但不能够无限的增加通风量,研究表明，当通风量增加到一定的量后，(Pg/V)会随着Q的增加而下降。也就是说单位体积发酵液所拥有的搅拌功率会下降，不但不能提高kLa，甚至会造成kLa

24、值的下降。可见，提高KLa最有效的方法是提高N与Vs，并协调两者之间的关系，其他方法效果不大，且受限制较多。（2）提高（c* - cL)，即氧传递动力：c*，改变c*是没有太大的余地的。因为，发酵温度、浓度等严格的受到菌体生长和发酵工艺的限制。提高罐压：Pi增加则与之平衡的Ci也会增加，对提高（c* - c)是有一定作用的。利用纯氧，可以提高（c* - cL)。缺点：价格较高，易引起爆炸消沫剂：加入消沫剂，分布在气液界面，增大了传递阻力，使KL下降。使用的消沫剂是表面活性物质，尽管会引起溶解氧浓度的暂时下降，但最终会改善发酵液的通气效率。离子强度：电解质溶液中的气泡比在水中的要小，所以有较大的

25、比表面积。因此同样条件下，电解质溶液的KL值也比水中的大。影响推动力的因素：如温度、电解质溶液等。2）从耗氧方面考虑：摄氧速率：r= QO2 .XX：菌体浓度QO2 ：遗传因子、菌龄、营养成分与浓度、有害物质的积累、培养条件。13.发酵过程泡沫产生的原因（1）通气搅拌的强烈程度：通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。（2）培养基配比与原料组成：培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。（3）菌种、种子质量和接种量：菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利

26、用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量（4）灭菌质量：培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。14.泡沫对发酵的危害1）降低发酵设备的利用率 2）增加了菌群的非均一性 3）增加了染菌的机会 4）导致产物的损失 5）消泡剂会给后面的提取工序带来困难6）泡沫中的代谢气体不易被带走，改变了生活环境，使菌体代谢异常，导致菌体提前自溶15.影响泡沫稳定性的因素泡径大小2）溶液所含助泡物的类型和浓度3）起泡液的粘度4）其它 温度，pH，表面电荷。16.泡沫的控制方法：1）物理消沫法 2）化学消沫法3）减少培养基中易起泡的成分4）减少培养基中

27、粘度大的成分5）适当减少通气量及搅拌转速物理消泡法：原理：靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。方法：罐内消沫法，最简单的就是在搅拌轴上部安装消沫浆。罐外消沫法，将泡沫引出罐外，消泡后，液体再返回罐内。优点：不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会。 缺点：不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素。化学消泡法：机理：当泡沫的表层存在着由极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强曲或加入某些具有强极性的物质与发泡剂争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破裂。当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以加入

28、某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂。15.常用消泡剂：天然油脂、聚醚类、高级醇、硅酮类、脂肪酸、亚硫酸、磺酸盐。其中最多的是天然油脂和聚醚类。天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉子油、鱼油及猪油等。 聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙烯甘油(GPE)。 它们以一定比例配置的消泡剂又称为泡敌。高级醇类：十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体一起使用。据报导，它与冷榨猪油一起控制青霉素发酵的泡沫，效果较好。聚二醇具有消沫效果持久的特点，尤其适用于霉菌发酵。 硅酮类：主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。适用于微碱的细菌发酵液。

29、8、 发酵过程参数检测和自动控制*补料的内容和策略*发酵过程中杂菌污染与控制1.发酵参数分类1）按参数性质分物理参数：温度、搅拌转速、压力、空气流量、表观粘度等化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量、溶解氧、溶解二氧化碳、排气O2和CO2浓度等生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等2）按检测手段分直接参数：能反映过程中菌体的生理代谢状况的参数，可通过传感器等测量仪器直接测量。在线检测参数：指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速；离线检测参数：指取出样后测定得到的参数，如残糖、菌体浓度。间接参数：不能

30、直接测量的，需根据基本参数通过计算求得的参数，如摄氧量、体积溶氧系数等2.温度（物理参数）：指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。 温度的高低与下列参数有密切关系：发酵中的酶反应速度，菌体生长速度，产物合成速度，氧在培养液中的溶解度，传递速度温度传感器：常用的有热电阻（铂电阻和铜电阻）、热电耦、双金属片3.pH（化学参数）：发酵过程中各种产酸，产碱生化反应的综合结果，与菌体生长和产物合成有重要的关系。pH的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。pH电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池。该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发电

31、池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。复合电极：将两支电极都装在一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，工业上在线检测大都使用这种电极。它结构紧凑，便于安装。4.菌体浓度：菌体浓度的大小和变化速度对生化反应有影响，特别是对抗生素等次级代谢产物的发酵，菌体浓度与培养液的粘度，DO都有关。细胞浓度的测量：化学法：如DNA、RNA分析等。物理法：如重量分析、分光光度分析、浊度分析等。新技术：以电容法为测量原理的在线活细胞浓度测量传感器。常用流通式浊度计，其原理是使发酵罐中的发酵液进入一流通式薄层比色杯，用波长500600nm的光束测量发酵液的光密度，然后发酵液再返回发酵罐中，所测度的OD值与细胞浓度成

32、线性关系。5名词解释：呼吸商RQ：发酵过程中二 氧化碳生成比速与氧的消耗比速的商。摄氧率OUR：菌体细胞氧的吸收率，就是单位体积培养液在单位时间内所消耗的氧量CO2释放率（CER）：单位体积发酵液在单位时间内产生的CO2量9、 微生物反应动力学1.类型（生长相关型）：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰菌体生长类型：终产物就是菌体本身，菌体增加与碳源利用平行。如酵母、蘑菇菌丝等。代谢产物类型：产物是碳源的直接氧化产物。产物积累与菌体增长相平行。如酒精、乳酸等。2.类型 （生长部分相关型）：微生物生长与产物合成是分开的：第一时期：菌体迅速增长，产物形成很少或无第二时期：产物高速

33、形成，生长可能有第二峰；碳源利用出现两高峰。（部分相关）其产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物，产量较高。分两类：产物的形成是经过连锁反应的过程；如：丙酮丁醇。产物的形成不经过中间产物的积累。如：谷氨酸。3. 类型（与生长不相关型）：一般产物形成是在菌体生长接近或达到最高生长时期（稳定期）。产物形成与碳源利用无准量关系，如：抗生素、维生素等次级代谢产物。产量一般不超过碳源耗量的10。4.产物形成与基质消耗关系分类：产物形成直接与基质（碳源)利用有关，产物形成间接与基质（碳源）利用有关，产物形成与基质（碳源）利用无关。发酵按照操作方法分：分批发酵，补料分批发酵，连续发酵。5.分批发

34、酵（batch fermentation)即分批培养：指一次投料、一次接种、一次收获的间歇培养方式。即是在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。 发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。阶段：分延迟期、对数生长期、减速期、稳定期和衰亡期。6补料分批发酵：半连续发酵或半连续培养，指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。7.连续发酵（continuous fermentation)即连续培养：在培养过程中（一般是微生物培养到对数生长期），一方面连续地向发酵罐中加入培养基，另一方面同时以相同的流速从发酵罐

35、中排出含有产品的发酵液。使发酵罐内料液 量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定 的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、 恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。8. 当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质的浓度间的关系用Monod方程式表示为： （S:限制性基质浓度mol/m3；KS:饱和常数mol/m3）KS：物理意义为当比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲和力大小。KS越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小，反之越大。µm：随微生物种类和培养的条件不同而不同。一般细菌的µ

36、m大于真菌的µm；。培养温度升高，µm增大；营养物质改变，µm改变；易被微生物利用的营养物质，其µm 较大。9.a:营养物质浓度很低，即S << KS时，为线性关系。dX/dt= µX提高 S，可明显提高µ，一级反应。b:适合Monod方程段c: S >> KS 营养物质浓度很高。µ=µm。µ与S无关，零级反应。当S时，µ=µm。µm是理论上最大的生产潜力假定整个生长阶段无抑制物作用存在，则微生物生长动力学可用阶段函数表示如下： 0 x0 （0<

37、t<t1) µm x0e µm t (t1<t<t2) µ = x= x0e µm(t2-t1) e µt (t2<t<t3) 0 xm (t3<t<t4) -a xme -a t (t4<t<t5)SC：临界基质浓度，比生长速率µ达到最大比生长速率µm时的最低基质浓度。 对于任一营养物质：S > SC 为非限制性基质， S < SC为限制性基质。10. Monod方程与米氏方程的区别与联系：Monod方程是对实验现象的总结：是经验方程。米氏方程是根据酶反应动

38、力推导得出：是机理方程Monod方程与米氏方程的相似性：双倒数法求解参数。双倒数法：将Monod方程取倒数可得：以1/S对1/µ作图，为一直线，斜率为KS/µm，纵轴截距为1/µm。11.维持系数（名词解释）：是微生物菌株的一种特性值，对于特定的菌株、特定的基质和特定的环境因素（如温度、pH等）是一个常数，故又称为维持常数。12.定义稀释率D=F/V，单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率恒定状态时dX/dt=0，=D，即在恒定状态下，比生长速率等于稀释率一定范围内连续培养的比生长速率可通过稀释率来控制十、微生物工程下游加工工程按生产过程的顺序分为四

39、大框架步骤：发酵液的预处理和过滤、提取、精制、成品加工。预处理的目的和要求目的分离菌体，将发酵液中的杂质除去，改变滤液性质以利于提取和精制后续各工序顺利进行。要求菌体的分离；固体悬浮物的去除；蛋白质的去除；重金属离子的去除；色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除；改变发酵液性质。预处理的方法高价无机离子的去除方法钙离子，可用草酸。草酸溶解度较小，用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。镁离子，可用三聚磷酸钠。它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提取。铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。 可溶性杂蛋白质的去除方法等电点沉淀法：等电点状

40、态，蛋白质溶解度最低加热处理：蛋白质变性，溶解度降低吸附作用:用凝胶吸附蛋白质有机溶剂、金属离子等沉淀蛋白质发酵液的凝聚和絮凝 凝聚：是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。 絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶体聚集形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。机理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子，或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。 方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。试剂包括酸、碱、简单电解质

41、和合成的高分子电解质。常用的絮凝剂：聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠等。十八、培养基灭菌及灭菌设备1.湿热灭菌：用饱和蒸汽进行灭菌的方法。原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。优点：蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。2.过滤除菌：用过滤的方法阻留微生物，达到除菌的目的。适用于澄清液体和气体的除菌。3.热阻：表示微生物对热的抵抗能力，指微生物在某一条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻：对数残留定律：分批

42、灭菌：连续灭菌：4.连续灭菌流程图：5. 喷射加热-真空冷却流程6. 薄板换热器连续灭菌流程：十九、发酵设备1.发酵设备分类：厌氧发酵设备和好氧发酵设备好氧发酵设备按照能量输入的不同，分为：内部机械搅拌型：如机械搅拌发酵罐、伍式发酵罐、 机械搅拌自吸式发酵罐等。外部液体搅拌型：依靠外部循环泵来搅拌发酵液，或在液体进入发酵罐处装有文丘里管，依靠液体的高速流动，吸入空气，使气液混合。空气喷射提升式：依靠压缩空气作为能量输入，促使发酵液上下翻动混合。2机械通风发酵罐图：机械通风发酵罐主要部件包括：罐身、搅拌器、挡板、冷却装置、空气分布器、轴封等。图为大型发酵罐结构3.各部件的主要功能和作用1）罐身：

43、是一个培养微生物的巨大容器，为要保持纯培养，防止污染杂菌，因此要求是密封式的。罐体形状为圆柱状，两端用椭圆形或碟形封头焊接而成，小型发酵罐罐顶和罐身采用法兰连接，材料一般为不锈钢。为便于清洗，小型发酵罐顶设有清洗用的手孔。中大型发酵罐则装设有供维修、清洗的入孔。罐顶还装有视镜及孔灯。在发酵罐的罐顶上的接管有：进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管。在罐身上的接管有冷却水进出管、进空气管、取样管、温度计管和测控仪表接口。 2）搅拌器：作用：将空气打碎成小气泡，增加气液接触界面，提高氧的传递速率，使发酵液充分混合，液体中的固形物保持悬浮状态。种类：轴向式、径向式（涡轮式）两种。轴向式搅拌器：桨

44、叶式、螺旋桨式。径向式（涡轮式）搅拌器：平直叶、弯叶、箭叶。3）挡板：作用：改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。通常，挡板宽度取(0.10.2)D，装设46块即可满足全挡板条件。全挡板条件（名词解释）：是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。 4）消泡器：作用：将泡沫打破。形式：锯齿式、梳状式及孔板式。孔板式的孔径约1020毫米。长度：约为罐径的0.65倍。 5）连轴器及轴承：大型发酵罐搅拌轴较长，常分为23段，用连轴器使上下搅拌轴成牢固的刚性联接。常用的连轴器有鼓形及夹壳形两种。小型的发酵罐可采用法兰将搅拌轴连接，轴的连接应垂直，中心线对正。为了减少震动，中型发酵罐般在罐内装有底轴