第十章吸光光度法

1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度计分光光度计10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素10.5 光度分析法的设计光度分析法的设计10.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光吸光光度法：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法度法，属于分子吸收光谱分析方法 基于外层电子跃迁基于外层电子跃迁10.1 概述概述n吸收光谱吸收光谱n发射光谱发射光谱n散射光谱散射光谱n分

2、子光谱分子光谱n原子光谱原子光谱10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光谱产生的原因吸收光谱产生的原因 光光: :一种电磁波一种电磁波, ,波粒二象性波粒二象性 光谱名称波长范围X射线0.110nm远紫外光10200nm近紫外光200400nm可见光400750nm近红外光0.752.5um中红外光2.55.0um远红外光5.01000um微波0.1100cm无线电波11000m当光子的能量与分子的当光子的能量与分子的 E匹配时，匹配时，就会吸收光子就会吸收光子 E=hu u=hc/l la 跃迁类型跃迁类型 价电子跃迁价电子跃迁：*, *; n*, n* E (h) 顺序:

3、n* n*104)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别 ( l l60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定生成有色化合物再测定 显色反应显色反应1 显色反应显色反应一显色反应和显色剂一显色反应和显色剂2. 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂： 肟类：丁二肟肟类：丁二肟CCCH3NNO HH OCH3邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 NNC H3C H

4、3N NN NSO3HHO3SOHOHAsO H32H O As32偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料: :铬天菁铬天菁S S OC H3C O O HH OCC lC lS O3HC H3C O O H 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料: :结晶紫结晶紫 CN ( C H3)2( H3C )2NN ( C H3)23.多元络合物多元络合物混配化合物混配化合物 V-PAR-H2O2 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸离子缔合物离子缔合物 AuCl4-罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTM

5、AB 二影响显色反应的因素二影响显色反应的因素1 溶液酸度（溶液酸度（pH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液）u a影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变lu b影响待测离子的存在状态，防止沉淀u c影响络合物组成形式形式 pH max(nm) 形式形式 pH max(nm)H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550H2L- 8.4-9.0 512HL2- 11.4-12.0 532-538pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响对苯芴酮及其络合物的颜色影响 2 显色剂的用量显色剂的用量稍过量，处于平台区稍过量，处于平台区 3 显色反应

6、时间显色反应时间针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定；显色反应快但不稳定； 显色反应慢，稳定需时间；显色反应慢但不稳定4 显色反应温度显色反应温度加热可加热可加快反应速度，导致显色剂或产物分解5 溶剂溶剂6 干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长选择适当波长 1 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则：“吸

7、收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性10.4 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制一一 测定波长的选择和标准曲线的制作测定波长的选择和标准曲线的制作2 标准曲线制作标准曲线制作0123456780.000.050.100.150.200.250.300.35Aconcentration理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标测定不同浓度标准溶液的吸光度准溶液的吸光度AAc 作图作图非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 二二.对朗伯对朗

8、伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移1 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移复合光由复合光由l l1和和l l2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯光度增加，导致线性关系上弯2 非均匀介质非均匀介质离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O =2HCrO4- =2H+2CrO42-

9、 PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 3.化学反应化学反应控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：0.20.8减少测量误差减少测量误差三三.吸光度测量的误差吸光度测量的误差吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀A0.434 ，T36. 8% 时，测量的相对误差最小时，测量的相对误差最小A=0.20.8, T=1565%，相对误差，相对误差4% dc/c= dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT1001.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(A在在0.20.8以外以

10、外)问题问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法精密差示吸光度法特点：特点： 以标准溶液作空白以标准溶液作空白原理：原理： A相对相对 = A = e ebcx- e ebc0= e eb c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少相对误差减少, c0愈接近愈接近cx, 准确度提高愈显著准确度提高愈显著10.5 其他吸光光度法其他吸光光度法例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸例：硫脲还原硫氰酸盐比色法测定钢铁中的钼。酸溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（溶，硫酸高氯酸介质中，硫脲还原铁（III）为铁）为铁(II),

11、除干扰，还原钼（除干扰，还原钼（VI）为五价，）为五价，2.00mg/100ml的的钼标准溶液为参比溶液，用钼标准溶液为参比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的钼标的钼标准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光准溶液，绘制工作曲线和测定样品溶液的吸光度度,480nm测定测定A。 2.双波长吸光光度法双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰消除背景吸收的干扰 多组分同时检测多组分同时检测 原理：原理： A = Al l1-Al l2 = （e el l1- e el l2）b c 波长对的选择：波长对的选择： a.等吸光度点法，等吸光度点

12、法，b.系数倍率法系数倍率法选选l l1为参比波长为参比波长, l l2为测量波长为测量波长得得 Al l1= e e xl l1bcx + e e yl l1bcy Al l2= e e xl l2bcx+ e e yl l2bcy A=Al l2-Al l1= (e e x2bcx+e e yl l2bcy)-(e e xl l1bcx+e e yl l1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G, F), e e yl l2 e e yl l1，则上式成为，则上式成为 A=(e e xl l2- e e xl l1）bcx A与与cx成正比成正比, 可用于测定可用于测定例例,苯酚与苯酚

13、与2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合混合物中苯酚物中苯酚(x)的双波长分光光度法的双波长分光光度法测定。测定。3.导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干扰去除背景干扰 原理：原理： dnA/dl ln l l 10.6 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1 测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以HB或B-形式存在。HB H+ + B- H+B-Ka = HBpKa=pH+ lg HBB-A=AHB+AB-pKa=pH+ lg AB- - AA- AHBlg AB- -

14、AA- AHB对对pH作图即可求得作图即可求得pKa 2 络合物组成确定络合物组成确定 饱和法（摩尔比法）饱和法（摩尔比法）制备一系列含钌制备一系列含钌3.010-5 mol/L (固定不变固定不变)和不和不同浓度（小于同浓度（小于12.010-5 mol/L）的）的PDT溶液，按溶液，按实验条件，实验条件，485nm测定吸光度测定吸光度,作图。作图。PDT:Ru=2:1等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法固定固定M+L,改变改变M,获得一系列吸光度值，获得一系列吸光度值，吸光度最大的值所对应的吸光度最大的值所对应的M与与L的比值，即的比值，即获得获得M:L比值。比值。Co(III)与与3，5二氯二氯PADAT的比值为的比值为