第8章荧光免疫试验

1、齐齐哈尔医学院免疫教研室齐齐哈尔医学院免疫教研室第八章第八章 荧光免疫试验荧光免疫试验 Fluoroimmunoassay 掌握：掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。与结果判断。熟悉：熟悉：荧光物质。荧光物质。了解：了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。技术的应用。教学目的教学目的第一节第一节 荧光免疫试验的组成因素荧光免疫试验的组成因素第二节第二节 间接免疫荧光试验间接免疫荧光试验第三节第三节 流式荧光免疫试验流式荧光免疫试验第四节第四节 其他与荧光检测相

2、关的免疫试验其他与荧光检测相关的免疫试验第五节第五节 荧光免疫试验的临床应用荧光免疫试验的临床应用第六节第六节 影响荧光免疫试验的主要因素影响荧光免疫试验的主要因素荧光免疫试验（荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):fluoroimmunoassay): 以荧光物质标记抗体和抗原，通过与以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行此对待测物进行定位、定性和定量定位、定性和定量分析的分析的检测技术，具有高度检测技术，具有高度特异性、敏感性和直特异性、敏感性和直观性观性，是，是最早最早出现的免疫标记技术。出现的

3、免疫标记技术。 荧光物质吸收激发光的能量后，荧光物质吸收激发光的能量后，电子从电子从基态基态跃迁到跃迁到激发态激发态，当其回，当其回复至基态时，以发射光形式释放出复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为能量，称为荧光荧光。 第一节第一节 荧光免疫试验的组成要素荧光免疫试验的组成要素吸收能量吸收能量激发态激发态 基态基态荧光效率荧光效率荧光特点：荧光特点： 1 1 可产生荧光的分子或原子在接受可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；能量后即刻引起发光； 2 2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；失；( (一一) )荧光的基本知识荧光的基本知识1.1.发射光谱发射

4、光谱: :指固定激发光波长，在不指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。2.2.激发光谱激发光谱: :指固定检测发射光波长，指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。光的谱图。 一一 荧光及荧光物质基础知识荧光及荧光物质基础知识荧光效率荧光效率 吸收光的光量子数（激发光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）荧光色素本身的物理特性荧光色素本身的物理特性激发光强度及激发光波长激发光强度及激发光波长决定于决定于决定于决定于3.荧光物

5、质将吸收的光能转变成荧光的百分率荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率-荧光效率荧光效率定义定义: :荧光物质被激发后所产生荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的的荧光衰减到一定程度时所用的时间。时间。各种荧光物质的荧光寿命不同各种荧光物质的荧光寿命不同。 4.4.荧光寿命荧光寿命5.5.荧光淬灭荧光淬灭: :荧光物质在某些理化因素荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。荧光淬灭。如紫外线照射、高温（如紫外线照射、高温（2020）、苯）、苯胺、酚、硝基苯、胺、酚、硝基苯、I I- -等等 。如何避免：如何避免： 勿长时间照射勿

6、长时间照射 脉冲瞬间照射脉冲瞬间照射 避光保存避光保存猝灭剂：猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质具有荧光猝灭作用的物质荧光淬灭荧光淬灭 荧光物质荧光物质最大吸收最大吸收光谱光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黄绿色）（黄绿色）FATFAT、荧光偏振免、荧光偏振免疫测定疫测定四乙基罗丹明四乙基罗丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或的衬比染色或双标记双标记FATFAT藻红

7、蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-490-560nm560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式、流式细胞术细胞术7-7-氨基氨基-4-4-甲基香豆素甲基香豆素354nm354nm430nm430nm（蓝色）（蓝色）双标记或多标记双标记或多标记FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm613nm613nm时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫测定测定（二）荧光物质（二）荧光物质荧光显微镜荧光显微镜 利用一定波长的激发利用一定波长的激发光对待测标本进行激发，光对待测标本进行激发，产生一定波长的荧光，产生一定波长的荧光，对组织细胞结构或其组对组织细胞结构

8、或其组分进行定性、定位和半分进行定性、定位和半定量分析检测。定量分析检测。 二、荧光显微镜二、荧光显微镜隔热滤光片：隔热滤光片： 位于位于灯室聚光器前，灯室聚光器前， 作用作用阻断红外线通过而隔热。阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：激发滤光片： 位于光源和物镜之间，位于光源和物镜之间， 作用能选择性地透过紫外线可作用能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，提供合适的激发光。见波长的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：吸收滤光片： 位于物镜和目镜之间，位于物镜和目镜之间， 作用阻断激发光而使发射的荧作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。光透过，保护眼睛。荧光显微镜荧光显微镜滤光片滤光片

9、透射光：透射光：照明光线从标照明光线从标本下经聚光器透过标本本下经聚光器透过标本进入物镜。进入物镜。落射光：落射光：照明光线从标照明光线从标本上经垂直照明器落射本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进到标本，经标本反射进入物镜。入物镜。透射荧光显微镜光路透射荧光显微镜光路(a)(a)落射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路(b(b) )荧光显微镜荧光显微镜光路光路1 1、抗体要求、抗体要求 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力 经纯化提取经纯化提取IgGIgG 三、荧光素三、荧光素-抗体结合物抗体结合物v有能与蛋白质形成共价健的化学基团有能与蛋白质形成共价健的化学基团v荧光效率高，荧光效率高，v荧光

10、色泽与背景组织的色泽对比度高。荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。v与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质。v标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。v与蛋白质的结合物稳定，易于保存。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。2 2 荧光素要求荧光素要求一、基本原理一、基本原理特异性抗体与相特异性抗体与相应抗原反应，荧应抗原反应，荧光素标记的抗抗光素标记的抗抗体再与第一抗体体再与第一抗体结合。结合。 间接荧光抗体染色法示意图间接荧光抗体染色法示意图 第二节第二节 间接免疫荧光试验间接免疫荧光试验间接免疫荧光法示意图间接免疫荧光法示意图间接法：间接法： 优点：优点：敏

11、感度高于直接法敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：缺点：易出现非特异性荧光易出现非特异性荧光 方法较麻烦方法较麻烦 操作时间较长操作时间较长 应用：应用：自身抗体的检测自身抗体的检测 标本片上滴加特异性抗体标本片上滴加特异性抗体3730min PBS3730min PBS洗涤洗涤 滴加二抗滴加二抗 3730min PBS3730min PBS洗涤洗涤 镜检镜检二、实验方法二、实验方法三、注意事项三、注意事项1.1.荧光染色时间：一小时内或荧光染色时间：一小时内或2828保存保存4 4

12、小时，小时，2.2.三种对照：阳对：阳性血清三种对照：阳对：阳性血清+ +荧光标记物荧光标记物 阴对：阴性血清阴对：阴性血清+ +荧光标记物荧光标记物 荧光标记物对照：荧光标记物对照：PBS+PBS+荧光标记物荧光标记物3.3.标本片需保持湿润，避免干燥标本片需保持湿润，避免干燥4.4.滴加抗体或荧光标记物滴加抗体或荧光标记物, ,始终保持在未知抗原标本始终保持在未知抗原标本上上 - -：无或仅见极微弱荧光。无或仅见极微弱荧光。 + +：荧光较弱但清楚可见。荧光较弱但清楚可见。 + + ：荧光明亮。荧光明亮。 +：耀眼强荧光。耀眼强荧光。 特异荧光强度特异荧光强度+ +以上判定为阳性，对照光应

13、呈以上判定为阳性，对照光应呈- -或或。根据根据+ +的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 荧光抗体染色及结果判断荧光抗体染色及结果判断第三节第三节 流式荧光免疫试验流式荧光免疫试验流式荧光免疫试验流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法。高通量分析的检测方法。悬浮阵列；流式微球阵列悬浮阵列；流式微球阵列 第第四节四节 其他与荧光检测相关的免疫试验其他与荧光检测相关的免疫试验其他荧光免疫试

14、验其他荧光免疫试验时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定自发荧光寿命短自发荧光寿命短:1ns:1ns10ns10ns镧系元素寿命长镧系元素寿命长:10s:10s1000s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光镧系元素特异荧光 （一）基本原理（一）基本原理时间分辨检测原理示意图时间分辨检测原理示意图1.1.时间分辨时间分辨一、时间分辨荧光免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定2.stokes2.stokes位移位移: :激发光谱和发射光谱的激发光谱和发射光谱的波长差波长差。 stokesstokes位

15、移小，相互干扰，影响结果准确位移小，相互干扰，影响结果准确性。性。镧系元素镧系元素StokesStokes位移大位移大(273nm)(273nm)，激发，激发光谱和发射光谱不重叠光谱和发射光谱不重叠时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定发射光谱带较窄：发射光谱带较窄：613nm613nm10nm10nm，干扰，干扰少少 激发光谱带较宽：激发光谱带较宽：300nm300nm350nm350nm，灵敏，灵敏度高度高3.3.发射光谱和激发光谱发射光谱和激发光谱时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定4.4.荧光标记物的相对比活性荧光标记物的相对比活性比活性比活性 ：单位时间内每个标记分子：单位时间

16、内每个标记分子可被探测到的信号量。可被探测到的信号量。EuEu3+3+螯合物螯合物 反复激发反复激发 10001000次次/ /秒秒大大提高了荧光标记物比活性大大提高了荧光标记物比活性时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定结合结合-二酮体二酮体EuEu3+3+解离解离酸性增强液酸性增强液荧光荧光增强增强EuEu3+3+标记标记抗原抗体抗原抗体复合物复合物5.5.信号增强信号增强时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（二）标记物和（二）标记物和标记方法标记方法时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（三）方法类型（三）方法类型 双抗体夹心法双抗体夹心法 固相抗体竞争法固相抗体竞争法 固相抗原

17、竞争法固相抗原竞争法时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定（三）方法类型（三）方法类型时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图图灵敏度高灵敏度高：最小检出量最小检出量1010-18-18mol/Lmol/L分析范围宽：分析范围宽：4 45 5个数量级个数量级标记物稳定：有效使用期长标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化测量快速，易自动化易受污染，本底增高易受污染，本底增高方法评价方法评价时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定光线通过偏振滤光片后，形成光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为一个方向的平面光称为偏振光偏振光。偏振荧光偏振荧光

18、( (绿光绿光,525nm,525nm550nm)550nm)偏振光偏振光( (蓝光蓝光,485nm),485nm)荧光物质荧光物质二、荧光偏振免疫测定二、荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应抗原抗体竞争反应AgAgF F分子小，转动速度快，偏振荧光弱分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgAgF F-Ab-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则若待检抗原多，则AgAgF F-Ab-Ab少，少，AgAgF F多，偏振荧光弱多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图荧光偏振免疫测定原理示意图 基本

19、原理基本原理方法评价方法评价 样品用量少样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好重复性好 快速，易自动化快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低灵敏度较非均相荧光免疫测定法低荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定第第五节五节 荧光免疫试验的临床应用荧光免疫试验的临床应用1.1.血清中自身抗体检测血清中自身抗体检测抗核抗体抗核抗体( (均质型均质型) )抗核抗体抗核抗体( (核膜型核膜型) )抗核抗体抗核抗体( (斑点型斑点型) )一、间接免疫荧光试验一、间接免疫荧光试验2.2.各种微生物的快速检查和鉴定

20、各种微生物的快速检查和鉴定寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌细菌（藤黄微球菌 ) )一、间接免疫荧光试验一、间接免疫荧光试验肿瘤（人肝癌细胞）肿瘤（人肝癌细胞）间接免疫荧光试验间接免疫荧光试验3 3、寄生虫感染的诊断、寄生虫感染的诊断4 4、白细胞分化抗原的检测、白细胞分化抗原的检测5 5、人类白细胞抗原的检测、人类白细胞抗原的检测6 6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测7 7、激素和酶的组织定位、激素和酶的组织定位（一）（一）时间分辨荧光免疫试验时间分辨荧光免疫试验二、其他荧光免疫试验二、其他荧光免疫试验1.1.内分泌学中的应用内分

21、泌学中的应用2.2.肿瘤学中的应用肿瘤学中的应用3.3.免疫学中的应用免疫学中的应用4.4.分子生物学的应用分子生物学的应用5.5.微生物学中的应用微生物学中的应用（二）荧光偏振免疫试验（二）荧光偏振免疫试验第六节、影响荧光免疫试验的主要因素第六节、影响荧光免疫试验的主要因素一、荧光素一、荧光素- -抗体结合物抗体结合物二、待检标本二、待检标本三、其他三、其他v荧光素荧光素- -抗体结合物的结合比率：抗体结合物的结合比率： F/P=F/P=nmnmAAA495280495nm35. 087. 2一、一、 荧光素荧光素-抗体结合物抗体结合物v抗体效价：抗体效价：双向免疫扩散试验双向免疫扩散试验v抗体纯度：抗体纯度：高亲和力、单克隆抗体高亲和力、单克隆抗体v抗体特异性：抗体特异性：吸收试验、