疟原虫血片制作

1、疟原虫血片的制作工需要材料1 .采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、干净的绸布或化纤布。2 .染色材料：姬氏原液.蒸储水或纯净水：稀释姬氏原液染色时冲洗染液固定剂：用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%）,固定薄血膜用无水乙醇擦洗油镜头。脱油剂：无水乙醍或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。油镜头脱油可用无水乙醍：无水乙醇的7:3混合液擦拭。擦镜纸。二、采血前准备：1 .玻片准备我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细

2、布擦干，擦亮，收藏好。已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取由，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好2 .玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。3 .采血时间：间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。所以在发作后的68小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。恶性疟原虫；从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血

3、液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此,较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。环状体的数量和构造。有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作710日后才能在末梢血液在由现，应当注意。4 .采血的部位和方法；部位：以耳垂采血为主。若由指头取血则受检者痛楚较大，且容易引起创口感染，一般不易采用。婴儿可采集足跟或拇指。方法：让受检者位于我们右前方，采集右耳垂血液，这样便于方便操作，以75%酒精棉球消毒耳垂，（

4、在消毒前挤由多余酒精）待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，稍用力挤压（酒精不干不能挤压，以免血液流生不成滴状，也不可用干棉花拭去多余酒精，因干棉花中碎纤维较多而污染血膜），采血后应尽快制作血片，时间过长会形成纤维蛋白，由现凝血。5,厚、薄血膜制作，染色：厚、薄血膜的形态和位置：薄血膜：宽2cm,长2.5cm.厚血膜直径0.81.0cm.假定将玻片划成三等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签用。厚血膜制作：待血液滴呈绿豆大小时，血量大约45ul用推片的左端下角刮取血滴，放于载玻片的右侧，自内向外涂成0.8

5、1.0cm直径的血膜，涂片结束前回转一下，使厚血膜均匀。厚血膜制作完毕，用酒精棉球擦去玻片上的血迹，再用干的干净的布拭去残留的酒精，厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到510个白细胞为宜。薄血膜的制备：用推片中央沾取一小滴血，在玻片左侧距离厚血膜约0.5cm处，与载玻片接触，推片与玻片约成25-35夹角，当血液沿推片的边缘扩展至2cm宽时向左边匀速推成舌状薄血膜。推成的血膜约成2cm宽X2.5cm长的薄血膜，薄血膜的用血量较少，约是厚血膜的1/10约为1.0ul1.5ul（有推荐用0.5ul1.0ul）即可。推片速度的快慢和角度均影响薄血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列

6、比较均匀，无裂缝、无空泡。采血完毕，用干棉花擦拭耳垂上的血液，推片上的血迹用酒精棉球擦去，再用干布擦干待用（不能使用掉纤维的布）。无论在擦拭玻片，制作血片或染色血片时，手指切勿触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血膜涂布不均厚血膜易于脱落。另外推片手持端应作标记，两端尽量不要混拿，以免人手经常拿捏，推片受到手上的油渍污染而影响血膜质量。血片干燥制成的血膜必须完全干燥后方可进行固定染色，否则薄血膜中红细胞边缘褶皱，厚血膜染色时易脱落，而由现网状的背景。反之，血片放置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能镜检。薄血膜在自然情况下约需10分钟，厚血膜需30分钟。应将血片用有盖器皿罩

7、住，防灰尘落入，放37c温箱，20分钟可干透。放入温箱干燥时间不能超过1周，否则染色后厚血膜背景颜色较深，影响观察。厚血膜如不能及时染色时，先将薄血膜固定，夏天应在48小时内，冬天应在72小时内对厚血膜进行溶血处理（不适用抗凝血），干燥后再保存。否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。注意：制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置的标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱掉。血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞沉在一边，可使厚薄不均。止匕外，还要防止苍蝇吮吸和灰尘污染。.固定、染色（姬氏染色法）干燥后的血片用棉签瓶取甲醇或无水乙醇在薄血膜上轻轻涂抹（最好是将甲醇倒入一个干净的50mL小烧杯中，将

8、薄血膜浸没其中，以减少棉签中的灰尘和碎纤维的污染），注意不要碰到厚血膜，否则使血红蛋白凝固，厚血膜不能镜检，约12分钟血片干后，即可进行染色。染液的稀释：染液在临用前要进行稀释，上面发放的姬氏为原液。其稀释方法：8m水（到空染色瓶的颈部）加10滴原液，染2025min,实际工作中我们经过比对，觉得8mL水加14滴原液能达到较为满意的效果，并根据血片的数量，按每张血片滴加染液1.52mL的量，配制稀释液量，稀释后的染色液最好一次用完，放置过久影响着色效果。若厚血膜过厚，可先滴加蒸储水数滴溶去血红蛋白，约需2min,时间不宜过长，否则血膜易脱落，倾去蒸储水，待血膜干后再滴加染液染色，或直接在厚血膜

9、上滴加2滴蒸储水后，不倒去蒸储水即刻直接滴加稀释染液（注：这两种方法对抗凝血不适用）使染液覆盖整个血膜。夏天染2530min即可，冬天需4060min能达到较为满意的效果。冲洗、干燥：血片染到时间后，用蒸储水冲洗，冲洗时不能对准血膜冲，应在无血膜地方注加蒸储水，使染液溢由，直到染液冲洗完，切不可先倒去染液，否则染液残渣吸附在血膜上即便再冲洗多遍也无济于事，或在一个盆中放入足够多水，将血片和染液一同浸入水中漂洗并在水中摆动几下（对于用抗凝血制成的血片，在冲洗时厚血膜极易脱落，所以只能用此种方法漂洗），对去除灰尘和染液残渣效果比较好。冲洗好的血片放于自然环境下12h,或37c温箱20min左右即可

10、镜检。染色效果判断：着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞的颗粒呈桔红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，中性粒细胞胞浆颗粒呈淡红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。除环状体外，其他各期均可查见痕色素。影响染色效果的因素：染料和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色结果。因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。染液的新旧：新配制的染液，一般着色力较弱，常呈碱性。染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前1-2周先将染液配好。盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量染液稀释后的使用时间：染液稀释后，一般在半小时内使用，时间

11、太长也会影响染色效果染液的浓度:染液浓度高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子抱子及痕色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。染色时间（应根据染液的质量、新旧、浓度和气温决定）；染色时间长，染色效果好，温度高着色快，染色用水的PH值（7.07.2）:当染色太蓝，可用PH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用PH较高的缓冲水冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以纠正。冲洗方法：染色后不能直接将染液倒掉。应将玻片连同染液一起放入水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢生，并轻轻冲洗，以免染色颗粒沾污血膜。附：瑞氏

12、染色与姬氏染色的区别瑞氏染色姬氏染色厚血片薄血片厚血片薄血片血用N作相同相同相同相同干燥2030分钟2030分钟2030分钟2030分钟厚、薄血膜染色前的处理用蒸储水溶去血红蛋白至血膜呈灰白色，干燥不需要处理不需要处理（若厚血膜较厚，可先溶血）用甲醇或无水乙醇固定染色液不需要稀释临用前用蒸储水稀释染色时间原液染色1分钟。再加蒸储水稀释后染78分钟。气温20c以上染3040分钟；20c以下染4060分钟。干燥2030分钟2030分钟镜检100X（油镜头）姬氏染色效果稳定，染色时间和染液浓度对结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时姬氏染剂能长期保存而不变质，染色技术也易掌握，被推荐使用，瑞氏

13、染色法因操作简便,常用于个别血片染色。三、镜检工作中所注意的事项1 .在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一定的顺序逐个检查。2 .疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人均需要进行疟原虫镜检。3 .做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴阳性片保存待查，4 .如发现恶性疟以最快的通信方式上报。四、实际工作中我们发现的几个常见问题归纳如下1 .血片制作不规范比较常 厚血膜血量较大，薄血膜用力不均匀，薄血膜制作较厚 血膜位置不规范，厚、薄血膜安排不当。厚、薄血膜间距离相隔过大 血膜太靠近玻片的边缘。 厚、薄血膜位置颠倒，方向错误，将薄血膜沿着厚血膜方向推，厚、薄血膜易相触2 .将姬氏染色方法与瑞氏染色方法混淆 姬氏原液不稀释，直接滴加在血膜上，使厚、薄血膜均被固定。厚血膜一团黑，不能镜检。 薄血膜未固定，直接用姬氏染色，薄血膜脱落。3 .染色时间不够，滴加染液后很快冲洗