马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉和蔗糖转化酶活性的相关性

1、马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉和蔗糖转化酶活性的相关性学校名称：内蒙古农业大学作者姓名：陆晓玉指导老师：霍秀文摘要本实验材料均为内蒙古田间统一收获的马铃薯块茎，选用中薯10号，中薯17号和费乌瑞它三个品种，收获后直接入窖贮藏，窖温保持在4摄氏度。三个品种都采用压热法测定抗性淀粉含量，用3,5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉-糖代谢酶中蔗糖转化酶的活性动态变化，通过数据比较的方法，研究马铃薯抗性淀粉和蔗糖转化酶活性的相关性。结果发现：通过块茎中蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量的相关性可知，马铃薯块茎中的蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量有显著的相关性，其中费乌瑞它（R=0.988）,中薯10号相关系数为（ R=0.

2、854），中薯17号相关系数为（R=0.999）。三个马铃薯品种均呈负相关。即蔗糖转化酶活性越强，则抗性淀粉含量越低。关键词：马铃薯；贮藏期；抗性淀粉；蔗糖转化酶活性Abstract The experimental materials are Inner Mongolia field uniform harvest of potato tubers in selection in potato, 10 potato, 17 and Favorita three v

3、arieties,harvested directly into the storage pit, pit temperature maintained at 4 degrees celsius. Three species are used for the determination of resistant starch content in hot press method, determination of the dynamic changes of the

4、0;activity of invertase of starch sugar metabolic enzymes by 3,5- two nitro salicylic acid colorimetry method, through the data comparison, correlation of Potato Resistant Starch and sucrose invertase activity. The results sh

5、owed: Through the correlation that invertase activity and the resistant starch content of tuber, from potato tuber invertase activity and resistant starch content had significant correlation, which Faye U Ray Tia (R= 0.988), in th

6、e potato 10 correlation coefficient (R= 0.854), in the potato 17 correlation coefficient (R=0.999). Three potato varieties were negatively correlated. That is, the stronger the invertase activity is lower, the resistant starch content.

7、Keywords: potato; storage period; resistant starch; invertase activit目录1引言61.1 马铃薯淀粉61.2马铃薯抗性淀粉61.3蔗糖转化酶81.4本实验研究的目的和意义82马铃薯抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的相关性分析102.1材料与方法112.1.1材料112.1.2仪器设备和试剂112.2抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的测定方法112.2.1马铃薯淀粉的制备112.2.2抗性淀粉的制备（压热处理法）122.2.3抗性淀粉含量的测定122.2.4葡萄糖标准曲线制定132.2.5蔗糖转化酶的提取和

8、活性检测143统计与分析163.1结果与分析163.1.1马铃薯块茎贮藏期蔗糖转化酶活性变化163.1.2马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉含量变化163.1.3三种马铃薯贮藏期抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的相关性分析183.2结论20展望21致谢22参考文献231引言1.1 马铃薯淀粉马铃薯为茄科植物是世界第四大粮食作物，以块茎为食用器官。马铃薯的人工栽培地最早可追溯到大约公元前8000年到5000年的秘鲁南部地区。如今中国的马铃薯主要产区是西南山区，西北，内蒙古和东北地区且我国马铃薯种植面积居世界第二位。马铃薯深受人们的喜爱，含有丰富的维生素A和维生素B以及矿物质和木质素，优质淀粉含量约为16.5%

9、。马铃薯作为主粮被誉为人类的“第二面包”；作为菜品是现如今营养学家青睐的蔬菜明星；作为工业原料更是被市场大量需求。目前，马铃薯加工产品主要为四大类，马铃薯食品，马铃薯粉条粉丝，马铃薯淀粉和马铃薯全粉。因此把握好马铃薯的深加工将会带来巨大的经济效益。马铃薯淀粉是薯类淀粉中的一种，由于其特殊品质而受到特别青睐。马铃薯淀粉是一种优质淀粉，具有其他任何淀粉不能替代的独特品质和功能，比如颗粒大，高粘性，易膨胀，口味温和无刺激，糊化温度低，糊化透明度高等。它也是造纸业，纺织业，食品加工业，饲料工业，油工业，铸造业等工业重要原材料。1.2马铃薯抗性淀粉抗性淀粉由于其具有无法被淀粉酶水解，也不能在人体的胃和小

10、肠中消化及吸收的良好理化特性和生理功能，1996年，抗性淀粉的概念被欧洲消化淀粉协会（EURESTA）做了界定与规范，即在健康人体小肠中不被消化和吸收的淀粉及其分解物的总称。1抗性淀粉本身仍是淀粉，其化学结构不同于纤维，但其性质类似溶解性纤维，因此被认为是膳食纤维的一种，但仍与膳食纤维有着本质的不同。抗性淀粉是一类具有低持水性，、无异味、多孔等特性的白色粉末。根据淀粉的来源和抗酶解性，将其分为四类，物理包埋淀粉（Physically inaccessible），抗性淀粉颗粒（Resistant Starch），回生淀粉（Retrograded Starch），化学改性淀粉（Chemically

11、 Modified Starch）。抗性淀粉拥有优良的生理功能，可以调节血糖代谢和控制胰岛素水平，改善肠道机能，促进锌，钙，镁离子的吸收，又因为抗性淀粉几乎不含热量，食用高含量抗性淀粉的食品能有效地减少对热量的摄取并增加脂肪的排泄，从而控制体重2。抗性淀粉不仅对人体有着极大的益处，在食品加工业中也扮演者重要角色。它可以作为食品增稠剂，膨化和脆性食品的改良剂，热量添加剂张，膳食纤维营养强化剂4。因此马铃薯淀粉经过深加工后产生的抗性淀粉具有极大的经济价值，抗性淀粉自1983年被发现以来，抗性淀粉产业便得到了飞速发展5。自上世纪90年代以来，抗性淀粉已成为研究热点。研究学者以马铃薯淀粉，大米淀粉为原

12、料探究抗性淀粉的制备工艺，发现马铃薯淀粉更适合用来生产抗性淀粉。1.3蔗糖转化酶大多数植物收获后仍然是一个活的机体，在贮藏过程中仍然进行着新陈代谢，这是影响植物贮藏的主要因素。【6】马铃薯抗性淀粉含量是内部和外部各因素综合作用的结果，但外部环境因素十通过改变内部代谢强度和方向来实现的。马铃薯块茎发育和贮藏过程中淀粉-糖代谢相关酶的活性直接决定淀粉中抗性淀粉的含量。马铃薯块茎中淀粉可以转化为蔗糖和还原糖，使块茎“糖化”，“糖化”后的块茎中蔗糖和还原糖又可以转变为淀粉，这些变化的方向和速率取决于品种，块茎的生理状态和贮藏条件。【7】现在研究学者对淀粉-糖代谢的酶已经研究的比较深入，几乎涵盖所有相关

13、的酶类。根据目前研究结果，腺苷二磷葡糖焦磷酸化酶，淀粉合成酶和分支酶是淀粉合成的三个关键酶。【8】蔗糖转化酶是植物体内有关蔗糖代谢的一类关键酶，又称 蔗糖酶或-呋喃果糖苷酶，它不可逆地催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。马铃薯低温贮藏期间，淀粉转化为还原糖过程中，淀粉酶，淀粉磷酸化酶和转化酶也发挥着重要作用 。本实验主要研究蔗糖转化酶活性与抗性淀粉相关性。1.4本实验研究的目的和意义了解并掌握马铃薯块茎中抗性淀粉与淀粉-糖代谢酶中的蔗糖转化酶活性的相关性；了解不同时期及收获后不同贮藏期马铃薯块茎中抗性淀粉的含量及与之相关的蔗糖转化酶的活性，从而分析两者之间的相关性。本试验通过对不同品种马铃薯块茎抗性淀

14、粉与蔗糖转化酶的相关性的分析，为今后马铃薯抗性淀粉的高效利用和优良品种的选育提供了一定的理论依据。2马铃薯抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的相关性分析马铃薯（Solanum tuberosum L.）块茎中含有丰富的碳水化合物，具有很高的营养价值和药用价值。早先马铃薯在我国主要做鲜食，近年来马铃薯加工业的迅速发展显示出马铃薯生加工在未来市场的高价值前景，工业对加工原料的品质要求越来越高，干物质，淀粉，可溶性糖含量就是很重要的指标。【9】淀粉是马铃薯块茎中的主要贮藏物质，其含量是评价马铃薯品质优劣的重要指标之一。抗性淀粉（Resistant Starch,简称 RS）又是淀粉中最有研究意义的一类，是

15、不被健康人体小肠吸收的淀粉及其水解物总称【9,10】，具有增加肠胃蠕动，降低餐后血糖浓度，减少心脏病发生频率等有重要作用的保健功能和医疗作用。马铃薯中的抗性淀粉有着非常大的价值，让国内外的研究学者对其进行更多更深入的研究，但大多只针对马铃薯数量性状相关性分析或数量性状及产量的相关性分析，而没有对抗性淀粉和淀粉-糖代谢酶活性的相关性分析，淀粉和蔗糖，还原糖之间的转换势必会影响到抗性淀粉的含量及性质等。故本实验主要研究抗性淀粉和淀粉-糖代谢酶中蔗糖转化酶活性的相关性。以期为今后马铃薯抗性淀粉的高效利用提供一定的理论基础。2.1材料与方法2.1.1材料实验材料:窖藏（4-6）6个月的3个马铃薯品种（

16、中薯10号、中薯17 号、费乌瑞它），乌兰察布市农业科学研究所提供。2.1.2仪器设备和试剂仪器设备：恒温水浴锅、紫外分光光度计、恒温培养箱、低速离心机、电子天平、万能粉碎机，恒温灭菌器 ，打孔器，研钵，量筒，烧杯，容量瓶，培养皿，锥形瓶，精密移液器，玻璃棒等。试剂：-淀粉酶, 普鲁兰酶, 胃蛋白酶。常规化学纯：1mol/l NaoH,1mol/l HCL,葡萄糖淀粉酶，无水乙醇，2mol/l KOH，3,5-二硝基水杨酸（DNS）；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 （G-6-PDH）;葡萄糖 磷酸变位酶（PGM）; AGPase 抽提缓冲液； 0.1·mol.L-1 磷酸 二氢钾-柠檬酸缓冲

17、液（pH 5.0）、0.1 mol·L-1蔗糖； DNS 试剂；80 mmol·L-1 Mes 缓冲液；5 mmol·L-1 NaF；100 mmol·L-1 蔗糖，5 mmol·L-1 UDP。2.2抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的测定方法2.2.1马铃薯淀粉的制备 将马铃薯清洗、剥皮并切成丝状放在小水桶里【11】，薯水比为1：3，静置时间为7h,然后搅拌用纱布过滤，用水洗涤，滤渣继续加水静置7h，把过滤出的淀粉乳液放在水桶里静置7h，倒掉上层液体，加第二次过滤的淀粉乳液，重复三次。最后加水搅拌继续静置7h。洗涤次数为23次，得到湿淀粉，把湿淀

18、粉放入60烘干箱烘干即得淀粉成品。2.2.2抗性淀粉的制备（压热处理法）将浓度为10%的淀粉乳，压热温度120分别处理60 min，取出后自然冷却，放置在4的冰箱储藏24h，取出至室温，加入1 u/g耐高温-淀粉酶，90水浴震荡30min，取出后自然冷却，加入4 u/g普鲁兰酶，60水浴震荡60 min，然后80烘干，粉碎，过100目筛，测定其抗性淀粉的含量，重复两次。2.2.3抗性淀粉含量的测定A.称取0.1g的淀粉样品，加入5ml的蒸馏水，调ph为2，再加入0.05g胃蛋白酶，37.c恒温水浴震荡1h，取出。B.冷却至室温，调节ph为6.0，加入300u耐高温a-淀粉酶，置于90.c的恒温

19、水浴振荡箱中震荡30min，水解其中的可消化淀粉。C.取出，冷却至室温，调ph为4.5，加入0.05g葡萄糖淀粉酶，60.c恒温水浴震荡12h，彻底水解可消化淀粉并转化成葡萄糖。D.取出，用无水乙醇沉淀，3500r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用80%的乙醇洗3遍，彻底洗去葡萄糖。E.加入4ml2mol/l的koH，加热使沉淀充分溶解。F.冷却至室温，调ph为4.5，加入0.1g葡萄糖淀粉酶，60.c恒温水域震荡75min彻底水解溶解后的抗性淀粉。G.取出，3500r/min离心10min，收集上清液于50ml的容量瓶，用蒸馏水洗涤沉淀，离心，合并上清液，重复3次。H.吸取1ml上清

20、液作还原糖含量测定，还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法。抗性淀粉含量为还原糖的量乘0.9。2.2.4葡萄糖标准曲线制定葡萄糖标准曲线的制定：取7支25ml刻度试管，编号，按如下操作。表2-1操作项目 管 号0 1 2 3 4 5 6葡萄糖标准液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水（ml）2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5-二硝基水杨酸（ml）1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5吸光度（A540）0.000 0.081 0.217 0.331 0.467 0.575 0.648 将各管摇匀，在沸水中加热5min

21、，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25min，用试管塞塞住试管口，颠倒混匀。在540nm波长下，用0号试管调零，分别读取16号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄样毫克数为横坐标，绘制标准曲线。2.2.5蔗糖转化酶的提取和活性检测取样方法：块茎取样参照 Tauberger 等方法：在04 条件 下进行。先用打孔器沿块茎的顶部至基部方向取样 35 次（较小块茎 3 次，大块茎 45 次），然后垂 直于上述方向再取样 3 次，将取下的样品切成 12 mm 薄片并混匀，组成平均样品。（1）蔗糖转化酶活性的测定：3,5二硝基水杨酸比色法【12】称取1g冷冻后的样品，加入4ml柠

22、檬酸缓冲液（0.5mol/L,ph=5.0）冰浴研至匀浆，冰冻离心5min，上清液于4度透析1h。于15ml刻度试管中加入0.6ml柠檬酸缓冲液，0.3ml蔗糖溶液（0.2mol/L），粗酶液1ml，以蒸馏水做空白，30水浴加热10min，加入0.5ml氢氧化钠溶液（1mol/L）终止反应，摇匀，加入2ml3.5-二硝基水杨酸，沸水浴加热5min，冷却定容至刻度，测定540nm下吸光度值。活性计算：每分钟水解产生1µmol葡糖糖所需要的酶量，定义为酶的一个活性单位（U）。蔗糖酶活性（U/g）=(r×n×v×1000)/(W×t)式中：r标准曲线

23、查得还原糖的量（mg）； n稀释倍数； v酶液总体积（ml）; W样品重（g）; t时间（10min）; 1000毫摩尔转化为微摩尔的倍数。3统计与分析3.1结果与分析3.1.1马铃薯块茎贮藏期蔗糖转化酶活性变化 图3-1是不同品种的马铃薯块茎在贮藏期蔗糖转化酶活性的变化，由图1可看出随着时间的增加，费乌瑞它、中薯10号、中薯17号中的蔗糖转化酶活性都在增加，其中费乌瑞它蔗糖转化酶活性最强，变化幅度也最大，中薯10号、17号变化幅度较小。图3-1马铃薯块茎贮藏期蔗糖转化酶活性变化3.1.2马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉含量变化 图3-2是三种马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉含量变化的趋势图，由图可见三种马铃

24、薯块茎的抗性淀粉含量都在下降，其中费乌瑞它下降幅度最大，中薯10号下降幅度最小，并且下降趋势随时间增加有所减缓。图3-2马铃薯块茎贮藏期抗性淀粉含量变化3.1.3三种马铃薯贮藏期抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性的相关性分析图3-3费乌瑞它贮藏期蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量的相关性图3-4中薯贮藏期蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量的相关性图3-5中薯17号贮藏期蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量的活性由图3-3、3-4、3-5可见在贮藏期，费乌瑞它、中薯10号、中薯17号的抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性都呈现出负相关的趋势。费乌瑞它相关系数（R=0.988）,中薯10号相关系数为（ R=0.854），中薯17号

25、相关系数为（R=0.999），表明马铃薯贮藏期其抗性淀粉含量和蔗糖转化酶活性有显著的相关性。蔗糖转化酶活性越强，抗性淀粉含量越低。蔗糖转化酶能够不可逆的催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和果糖，增加了可溶性糖含量。抗性淀粉形成的影响因素很多很多，可以简单的分为内因、外因。内因如植物的种类、材料的大小、直链淀粉含量/支链淀粉含量，植物成分中的可溶性糖的含量，抗性淀粉含量和可溶性糖含量相关性为（R=0.17216）【13】。Farhat的研究结果认为可溶性糖和淀粉竞争与水的结合，大大的推迟了淀粉的糊化，从而使其重结晶度降低，严重的抑制了老化过程，降低了抗性淀粉的含量。【14】。本实验研究结果与其相符，

26、在马铃薯贮藏期蔗糖转化酶活性和抗性淀粉含量呈负相关，即随着蔗糖转化酶活性的增强，抗性淀粉含量降低。3.2结论马铃薯贮藏期蔗糖转化酶活性和抗性淀粉含量的相关性分析表明，蔗糖转化酶活性与抗性淀粉含量存在着显著的负相关性。这为选育不同类型马铃薯提供了理论基础。我们在选育高抗性淀粉马铃薯品种时，可间接选育在贮藏期蔗糖转化酶活性较低的品种，如本实验的中薯10号。也可以进行研究出新方法抑制马铃薯贮藏期蔗糖转化酶活性，来提高抗性淀粉含量。本实验的研究对进一步提高马铃薯内抗性淀粉含量提供了一定的理论依据。展望 本实验仅研究了贮藏期马铃薯抗性淀粉含量和淀粉-糖代谢酶中的蔗糖转化酶活性的相关性。而淀粉-糖代谢酶种

27、类较多，如腺苷二磷葡糖焦磷酸化酶，淀粉合成酶和分支酶淀粉酶，淀粉磷酸化酶等，它们在淀粉-糖代谢中都有着不可忽视的作用，与抗性淀粉含量变化都可能有着重要关系，需要进一步深入研究，以期促进马铃薯抗性淀粉研究的进步，提高抗性淀粉产量，产生更大的价值。致谢 本论文是在导师霍秀文教授的耐心指导下完成的。从一开始确立研究课题到研究中注意点，到最后论文的完成，霍老师提出了许多指导性建议。让我们明确自己的研究方向，让我们有信心完成这份论文。在实验过程中我们认识到了很多实验仪器的使用，学习到许多实验规则，看到了严谨、细心、耐心的重要性。这些优秀的品质将会影响我们未来的人生道路。 在试验期间，也获得了魏娜，杨文等

28、师姐的帮助，对我们的实验进行辅导，给我们提供各种资料，遇到试验中存在的小问题时也积极想办法帮我们分析，提出建议和意见。这一路走来有过困难，有过分歧，感谢但因为有你们支持，让这些都成为我们前进的动力。在以后的学习工作中定会严格要求自己，继续努力，不让你们失望。 参考文献【1】Bajhurst R A.Dietary fiber,nonstarch polysaccharide and resistant starch J.Food Australia,1996,48(3):1-35【2】Ranhotra GS, Gelroth JA, Glaser BK. Effect of resistant starch on blood and live lipids in hamsters,Cerel Chem”1996a 73(2):176-178【3】张灵超. 马铃薯块茎抗性淀粉形成的影响因素及理化特性的研究D. 呼和浩特: 内蒙古农业大学，2014【4】Yue P,Waring S.Functionality of resistant starch in food applications J.Food A