分子生物设计性实验ars307完成内科大

1、分子生物学设计性实验设计人:温鑫 史客松学院：数量与生物工程学院专业：13生物工程1班设计的总体思想目的基因的查找 设计引物 PCR扩增目的DNA 片段 双酶切 重组序列 准备载体 双酶切 转化或转染 繁殖筛选 感受态细胞的制备 一：puc18载体自身带有抗氨苄青霉素基因，而外源片段不具有，这样只有带有puc18的转化子的菌株才能在氨苄青霉素平板上存活，而外源片段自身环化的不能存活。二：pUC18 上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列，在这个编码区中插有一个多克隆位点，且不影响正常功能，DH5感受态菌株带有-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信

2、息，当puc18载体在正常情况下同感受态菌株融合后，互补表达有活性的-半乳糖苷酶，当有外源片段插入多克隆位点后，不能产生互补，即细菌不能产生-半乳糖苷酶活性。在呈色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷酶）和诱导物IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）的存在下，互补产物菌落呈现蓝色，不互补产物菌落呈白色，很容易鉴别，这种筛选方法称为-互补现象筛选(蓝白斑筛选)。我们根据以上Puc18特点设置此实验，预计实验结果目 录一 目的基因的查找4二 设计引物8三PCR扩增目的基因及产物纯化 10四Puc18载体的准备 12五限制性内切酶和酶切buffer的选择 19六Puc18载体和目的基因双

3、酶切 20七、琼脂糖凝胶电泳检测DNA 21八目的基因和Puc18酶连 22九大肠杆菌感受态细胞制备 22十大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞及其筛选鉴定 24一、 目的基因的查找1. 查找过程ARS在第三号染色体的位置2.搜索结果：ARS307 Chr 3LOCUS AF087952 654 bp DNA linear PLN 12-NOV-1999DEFINITION Saccharomyces pastorianus ARS307-like genomic sequence, including putative phosphatidylserine synthase gene, parti

4、al cds; and unknown gene.ACCESSION AF087952VERSION AF087952.1 GI:3695283KEYWORDS .SOURCE Saccharomyces pastorianus ORGANISM Saccharomyces pastorianus Eukaryota; Fungi; Dikarya; Ascomycota; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Saccharomycetaceae; Saccharomyces.REFERENCE 1 (bases 1 to

5、 654) AUTHORS Theis,J.F., Yang,C., Schaefer,C.B. and Newlon,C.S. TITLE DNA sequence and functional analysis of homologous ARS elements of Saccharomyces cerevisiae and S. carlsbergensis JOURNAL Genetics 152 (3), 943-952 (1999) PUBMED 10388814REFERENCE 2 (bases 1 to 654) AUTHORS Yang,C., Theis,J.F. an

6、d Newlon,C.S. TITLE Conservation of ARS elements and chromosomal DNA replication origins on chromosomes III of Saccharomyces cerevisiae and S. carlsbergensis JOURNAL UnpublishedREFERENCE 3 (bases 1 to 654) AUTHORS Yang,C., Theis,J.F. and Newlon,C.S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (31-AUG-

7、1998) Micro. & Mol. Genet., UMDNJ-New Jersey Medical School, 185 South Orange Ave., Newark, NJ 07103, USAFEATURES Location/Qualifiers source 1.654 /organism=Saccharomyces pastorianus /mol_type=genomic DNA /strain=244 /db_xref=taxon:27292 /chromosome=III /note=Carlsberg lager production strain misc_f

8、eature 1.654 /note=similar to Saccharomyces cerevisiae ARS307 CDS 654 /gene=similar to Saccharomyces cerevisiae PEL1 CDS 421.654 /gene=similar to Saccharomyces cerevisiae PEL1 /note=similar to Saccharomyces cerevisiae Pel1p /codon_start=1 /product=putative phosphatidylserine synthase /protein_id=AAC

9、62759.1 /db_xref=GI:3695285 /translation=MTTRLLQLTRPHYRLLSSPFRKSSIIQRQMSASSPSPANSYLNM ITKSLQHNLQTWFHFEPNEIDIIESPSHFYDLLKORIGIN 1 ccaccaacga gaccctaatg tctctttcca atagagccaa ccttcgaaga aatgtgagtg 61 atgccgacat cgttaatatc aaggctttaa gaagaaattc aagatgaaac ggccattact 121 tcttcacatt cactaataaa taataatcga

10、 gatggtaaat aattaattag ttacataggc 181 tccgcattat actctttagc atattcttcc cttttcttct cttcccttca tgtttcgttt 241 tgtaacttga atatcaagaa gaaaacatta aaaagaaaaa gcaatagcgg aactacaaat 301 tgaaaagatt agtgttcaat ttcccctaaa aagtaacata cctaaaaata gcaaagaaat 361 agcccttcct accttactca ttcatagttg ctaatagcac atccagga

11、cc acgaatattc 421 atgacgactc gtttgctcca acttactcgt cctcattata gattattatc ctcacctttc 481 cgcaaaagct ccatcataca aaggcaaatg tctgcttcaa gcccttctcc agccaatagc 541 tatttgaaca tgattactaa gtctctacaa cataatctac agacatggtt ccatttcgaa 601 ccaaacgaaa tcgacatcat tgaatcaccc tcacattttt acgaccttct aaaa/二、 设计引物1引物的搜

12、索2：引物的结果：三PCR扩增目的基因及产物纯化1.实验设备及器材：2. 设计原则：（1）、引物长度约为16-30bp （2）、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的解链温度Tm4(G+C)+2(A+T)，且接近72最好。 (3）、四种碱基应随机分布，在3端不存在连续3个G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。(4)PCR过程 (5)PCR产物的纯化纯化后就得到比较纯的扩增的目的基因四：Puc18载体的准备1.查找过程：2.搜索结果： pUC18TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAG

13、CTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTAGAGGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGG

14、ATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGGGTTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAA

15、CTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGCTAGGAGCTTGCGGCCCGGACGATATCATGCATGAGCTCACTAGT

16、GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGAAGCTTGGGCCCGGTACCTCGCGAAGGCCTTGCAGGCCAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTGGGCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGA

17、GGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACCCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCGAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACC

18、CTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACT

19、AGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATA

20、TATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGT

21、TCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAA

22、TAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAA

23、TATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC3.载体的制备 实验设备及器材：（1）仪器 微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（2）材料 含有质粒的大肠杆菌DH5a（3）试剂及溶液 LB培养基、葡萄糖 （4）用于碱法提取质

24、粒DNA的溶液溶液I :50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH 8.0) ，10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0) 溶液II : O.4 mol/L NaOH，2% SDS，用前等体积混合 溶液III : 5 mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL (5)缓冲液: TBE缓冲液(10)：称取Tris 108g，硼酸55g，（）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.

25、0, 其中含有RNase20g/Ml(6)其他试剂:异丙醇,70%乙醇等(7)实验内容：用碱裂解法提取DNA1.将2 mL含相应抗生素(Amp：50g/mL)的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUCl9质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜。 2取1.5 mL培养物倒入微量离心管中，4 000 r/min离心2 min。 3吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 4将细菌沉淀悬浮于100L溶液I中，充分轻柔混匀。 5加200L溶液II(新鲜配制)，盖紧管，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。 6加入150L溶液III(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置10 min。 712 000 r/

26、min，离心15 min，将上清转至另一离心管中。 8向上清中加入等体积酚：氯仿(1:1)(去蛋白)，反复混匀，12 000 r/min，离心5 min，将上清转移到另一离心管中。 9向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5-10 min。12 000 r/min离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 10.用1 mL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 11加20LTE缓冲液，其中含有20g/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20C 保存。五限制性内切酶和酶切buffer的选择1.限制性内切酶选择的依据： 我们在查

27、找载体的时找到其酶切位图：由上图中我们知道pUC18存在EcoRI识别位点和 HindIII识别位点且可以获取比较大的基因序列。EcoRI识别位点 HindIII识别位点 ：注：只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。所以我们选择：1XM+BSA（附带测定buffer的活性）咪唑 68.08 50mmol/L 3.40g（缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子）KCl，B-巯基乙醇 78.13 1.0 mmol/L 70ul，加水定容至

28、六Puc18载体和目的基因双酶切1实验设备及器材：（1）仪器 ， 微量移液器 ， 常用玻璃器皿 ， 电泳仪， 电泳槽 ， 凝胶成像系。（2）.材料 实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA（3）.试剂 EcoR酶解缓冲液（10）：1mol/LpH 7.5 Tris2， Hind酶解缓冲液（10）：LpH 7.4 Tris .HCl,1mol/L，2.2.实验内容：（1）将上一试验提纯并溶于20L TE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需试剂. 质粒样品 酶解缓冲液酶液 自提质粒16L 2L2L 标准质粒16L 2L2L加样后小心混匀，置于37水浴中酶解半小时（有时可以长一点

29、，数小时或过夜），然后向管中加入上样液4L后等待电泳分析。（2）加样 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 （3）电泳 1. 接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。 2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。 （4）染色 将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色(15 min)以观察在琼脂糖凝胶中的带(戴手套操作)。七、琼脂糖凝胶电泳检测DNA(1).仪器 : 微量移液器 , 常用玻璃器皿 , 电泳仪 , 电泳槽 , 凝胶成像系统. (2).材料 :

30、实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA(3).试剂 : TBE缓冲液(10)：称取Tris 108g，硼酸55g，（）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10贮藏，稀释10倍后为工作液使用. 上样液（6）：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%蔗糖水溶液 溴化乙啶染色液（10mg/Ml）：在20mLH2O中溶解克溴化乙啶，混匀后于4避光保存。(4)实验内容：称取克琼脂糖(配置0.8%琼脂糖凝胶)，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。此外也可用沸水浴或高压锅加热溶解琼脂糖。胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晒干放入

31、制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔中，每加完一个样品，换一个加样头，加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面。对加完样后的凝胶板通电进行电泳：建议在80V100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离到胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压下，线性DNA片断的迁移速度与电压成比例关系。但

32、在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片断泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小，为了获得电泳分离DNA片断的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm.电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行，在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4进行电泳。染色观察：将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶（浓度为g/mL ）的电泳缓冲液中，染色约20min，在紫外灯（254nm或302nm波长）下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。一般紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应带上防护眼镜或有机

33、玻璃防护面罩，避免眼睛遭受紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳条谱。八、目的基因和Puc18酶连2.材料：pUC18、目的片段3.试剂：DNA连接酶缓冲液、T4 DNA Ligase、灭菌水载体6ul目的片段10ulDNA连接酶缓冲液2ulT4 DNA Ligase1ul灭菌水1ul九、大肠杆菌感受态细胞制备1.实验设备及器材：仪器和材料: 恒温摇床， 电热恒温培养箱 ， 超净台， 分光光度计， 台式离心机 ， 离心管 ，大肠杆菌DH5a Puc19质粒DNA， Eppendorf管 ， 移液器 ， 液氮 2. 试剂:（1）基本培养基 在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷

34、却至55在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）（2）LB培养基（1L）将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含氨卞青霉素的LB培养基，则将15克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55,向其中加入的氨卞青霉素。3.实验内容：1)氯化钙法制备的感受态细胞的转化 1.将1ng-10ng(5l-10L)质粒DNA加于无菌离心管中,再用缓冲液(Tris10mmol/L,

35、pH7.7,0.1mmol/L EDTA)将体积调至100mL置于冰上. 2.待感受态细胞在冰上融化后,向含有质粒DNA的离心管中加入200L,混匀并在冰上静置30min. 3.将离心管放入42水浴中2min对细胞进行热处理. 4.向上述试管中加入1mL预热(37)的LB培养液,于37下振荡培养(250r/min)1h. 5.将50L-100L上述培养液平铺于含有合适抗生素的LB固体培养基上, 37培养过夜. 2)一步法 1.过夜培养细菌,每一转化反应需1mL过夜培养物. 2.将1mL细菌过夜培养物加入微量离心管中,在微量离心机中1000 r/min离心2min,弃去上清液. 3.将沉淀细胞重

36、悬于100L TSS溶液中.细胞可用于转化反应,也可在干冰/乙醇浴中,存于-70储存期可长达4个月.用时可在冰上缓慢解冻后立即使 用. 4.每管加入10ngDNA混合均匀,于冰上温育10min. 5.将含20mmol/l葡萄糖的TTS溶液加入每管,37震荡培养1h. 6将细菌培养液铺板于含适当抗生素的LB培养基上,37培养过夜.注意:步骤4对保温时间的要求并不严格,可从5min-60min不等,一般转化率约为1gDNA106-108个菌落.3)快速冷冻法(使用本法转化大肠杆菌仅需10min,但其转化率可能不如一步法高) 1.制备新鲜感受态细胞或在冰上解冻感受态细胞. 2.于每管中加入高达10ug的DNA,将样品于干冰/乙醇浴冷冻30s-1min.3于室温解冻细胞,将细胞铺板于选择性培养基平板.转化率约为1ugDNA105-106个菌落.十、大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞及其筛选鉴定1设计理念pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的载体，通常运用于重组dna的分子克隆中，首先我们制备