实验九底物浓度对酶促反应速度的影响

1、 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响 实验目的实验目的 1 1 了解底物浓度对酶促反应速度的影响。了解底物浓度对酶促反应速度的影响。 2 2 学习测定米氏常数的原理和方法。学习测定米氏常数的原理和方法。 实验原理实验原理19131913年，年，MichaelisMichaelis和和MentenMenten提出了酶促反应速度和底物浓提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。度的关系式，即米氏方程。V VS / ( Km+S )S / ( Km+S )式中：式中： 为反应初速度为反应初速度 V V为最大反应速度为最大反应速度 SS为底物浓度为底物浓度 KmKm为米氏

2、常数为米氏常数 KmKm值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。力。 Lineweaver-BurkLineweaver-Burk作图法是用实验方法测定作图法是用实验方法测定KmKm值的最常用的值的最常用的方法。方法。1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数米氏常数KmKm的的测定测定n 实验时选择不同的实验时选择不同的SS，测定相对应的，测定相对应的。求。求出两者的倒数，以出

3、两者的倒数，以1/1/对对1/S1/S作图，则得到一作图，则得到一个斜率为个斜率为K Km m/V/V的直线。将直线外推与横轴相交，的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为：其横轴截矩为：1/S1/S1/ K1/ Km m，由此求出，由此求出K Km m值。值。该法比较简便。该法比较简便。n 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-BurkLineweaver-Burk双倒数作图法测定双倒数作图法测定K Km m值。值。n 胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（L L精精氨酸和氨酸和L L赖氨酸）的羧基所形成

4、的肽键水解。赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判断水解时生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。自由氨基增加的数量来追踪反应。n甲醛滴定法甲醛滴定法 由于氨基酸分子在溶液中主要是两性离子，故不能用酸、碱滴定其含由于氨基酸分子在溶液中主要是两性离子，故不能用酸、碱滴定其含量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟甲基和二羟甲基氨基酸，使上述平衡向右移量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟甲基和二羟甲基氨基酸，使上述平衡向右移动，促使氨基酸分子上的一动，促使氨基酸分子上的一NH3NH3十基解离释放出十基解离释放出 H+H+，从而使溶液酸性增加，

5、就可以酚，从而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示剂用酞作指示剂用 NaOHNaOH来滴定。来滴定。n小知识点：小知识点：n酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红。剂比如甲基橙甲基红。 n三、器材三、器材 n 锥形瓶锥形瓶 滴定管滴定管 移液管移液管 水浴水浴锅锅 量筒等量筒等n四、试剂与材料四、试剂与材料n 1. 1. 酪蛋白酪蛋白n 2. 2. 胰蛋白酶胰蛋白酶n 3. 3. 甲醛甲醛n 4. 4. 酚酞酚酞n 5. 5. 氢氧化钠氢氧化钠 五、操作五、操

6、作 分别向分别向6 6个小锥形瓶中加入个小锥形瓶中加入5 mL5 mL甲醛溶液和甲醛溶液和1 1滴滴酚酞，并滴加酚酞，并滴加0.1 mol/L0.1 mol/L标准氢氧化钠溶液，直至标准氢氧化钠溶液，直至混合物呈微粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应混合物呈微粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应一致。一致。 取取100 mL100 mL酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在3737水浴中保温水浴中保温1010分钟。将胰蛋白酶也在分钟。将胰蛋白酶也在37 37 水水浴中保温浴中保温1010分钟。然后精确量取分钟。然后精确量取10 mL10 mL酶液加到酪酶液加到酪蛋白溶液中

7、（同时计时）。蛋白溶液中（同时计时）。 充分混合后，随即取出充分混合后，随即取出10 mL10 mL反应混合物反应混合物（作为零时的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。（作为零时的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。用用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液滴定，溶液滴定，直至混合物呈微粉直至混合物呈微粉红色，红色，记下所用记下所用0.1 mol/LNaOH0.1 mol/LNaOH溶液的溶液的mLmL数。数。 在在2 2、4 4、6 6、8 8和和1010分钟时，分别取出分钟时，分别取出10 mL10 mL消化消化样品，准确照上法操作。注意：在每个样品中滴定终样品，准确照上法操作。注意

8、：在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。定初速度。 配制不同浓度的酪蛋白溶液（配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.57.5、1010、1515、2020、30 g/L30 g/L）测定不同底物浓度时的活力。）测定不同底物浓度时的活力。 用实验测得的结果，以以用实验测得的结果，以以1/1/对对1/S1/S作图，求作图，求出出V V和和KmKm的数值。的数值。 n【注意事项】【注意事项】n1 1实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下

9、降。原因随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pHpH及温度下及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。度为准。n2 2本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。确的酶促反应时间。n【实验结果】【实验结果】n1 1测定并计算酶促反应速度。测定并计算酶促反应速度。n2 2用实验所得的反应速度，对相应的底物浓用实验所得的反应速度，对相应的底物浓度作图。度作图。n【实验报告】【实验报告】n总结实验结果，并回答如下问题：总结实验结果