剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及相关功能研究

1、FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义研究摘要 目的：观察FoxM1剪接异构体在女性上皮性卵巢癌中的表达特征，并探讨其应用价值。方法：恶性组50例，为经手术治疗及术中获取病灶组织病理检测确诊的上皮性卵巢癌患者；良性组50例，为影像学及病理诊断为卵巢良性肿瘤者；健康组50例，为其它妇科疾病入院但经临床症状、影像学检查等未见卵巢异常者。均取卵巢病理组织切片免疫组化染色，免疫荧光法检测FoxM1表达阳性情况。结果：恶性、良性和健康组卵巢组织FoxM1的表达阳性率比较差异具有统计学意义（X2=62.632，P<0.01），两两比较，恶性组显著高于良性组及健康组（X2=27.473，

2、60.864，P<0.01），良性组显著高于健康组（X2=10.187，P<0.01）。不同临床分期的上皮性卵巢癌样本FoxM1的表达差异具有显著性，I、II期病变FoxM1阳性率显著低于III、IV期（X2=5.882，P<0.05）。但浆液性乳头状囊腺癌FoxM1阳性率与非浆液性乳头状囊腺癌比较差异无显著性（X2=0.039，P<0.01）。恶性肿瘤患者随着FoxM1表达增强，患者的3年生存率（OS）和无进展生存率（PFS）逐渐下降。结论：FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中呈现为高表达，且随着临床分期的增高FoxM1的阳性率提高，随FoxM1表达增高恶性肿瘤患者的

3、生存率下降，FoxM1可能参与卵巢癌的发生与进展过程，其机制可能与FoxM1的细胞周期调控作用有关。关键词 FoxM1剪接异构体，上皮性卵巢癌，基因表达，细胞周期The expression and clinical significance study of FoxM1 isoforms in epithelial ovarian cancerAbstract Objective: To observe expression features of FoxM1 isoform in women with epithelial ovarian cancer, and to explore it

4、s value. Methods: 50 cases of malignant group, were the patients treated by surgery and got intraoperative detection of pathological lesions diagnosed epithelial ovarian cancer; 50 cases of benign group, were patients of diagnostic imaging and pathological ovarian benign tumor; 50 cases of healthy g

5、roup, were patients admission but for other gynecological diseases by clinical symptoms, imaging studies, such as no ovarian abnormalities. Ovarian pathology tissue sections were taken immunohistochemistry, FoxM1 expression positive situation was detected by immunofluorescence. Results: The differen

6、ce of FoxM1 ovarian tissue expression rate of malignant, benign and healthy group was statistically significant (X2= 62.632, P <0.01), pairwise comparison, the malignant group was significantly higher than that of benign group and the healthy group (X2=27.473, 60.864, P<0.01), the benign group

7、 was significantly higher than the healthy group (X2 = 10.187, P<0.01). The difference of expression in epithelial ovarian cancer samples FoxM1 of different clinical stages was significant, the FoxM1 positive rate of I, II lesionswas significantly lower than the III, IV stage (X2=5.882, P<0.05

8、). But the difference of FoxM1 positive rate of serous cystadenocarcinoma and non-serous cystadenocarcinoma was not statistically significant (X2=0.039, P<0.01). FoxM1 cancer patients with increased expression of the patient's 3-year survival (OS) and progression-free survival (PFS) declined.

9、 Conclusion: FoxM1 isoforms appear as high in epithelial ovarian cancer expression, and FoxM1 positive rate increased with increased clinical stage, the survival rate of cancer patients with increased expression FoxM1 decline, FoxM1 may be involved in the occurrence and progression of ovarian cancer

10、, which may be related to cell cycle regulation of FoxM1 concerned.Keywords FoxM1 isoform, Epithelial ovarian cancer, Gene expression, Cell cycle女性生殖系统恶性肿瘤中，卵巢癌发病率较高，近些年来受到临床重视。由于卵巢癌早期无特异性症状，且目前的筛查手段尚无较好的早期诊断方法，多数患者发现病变已至晚期，延误了最佳治疗时机，患者病死率较高1-2。在卵巢癌的多种病理类型中，上皮性卵巢癌较为常见，约占70%，流行病学研究显示其多发于女性绝经期以及绝经后3。F

11、ox为叉头框转录因子的统称，共同特征是都有一段翼状螺旋DNA结构域。其成员FoxM1被认为在恶性肿瘤的发生与发展过程中具有重要作用，但我国相关基因学研究较少4。现对我院上皮性卵巢癌、卵巢良性肿瘤以及健康卵巢样本进行比较研究，观察FoxM1剪接异构体在女性上皮性卵巢癌中的表达特征，并探讨其应用价值。1 资料与方法11样本选择样本来源于我院妇产科患者，样本纳入时间为2009年1月至2011年12月。样本纳入类型：（1）恶性组50例，为经手术治疗及术中获取病灶组织病理检测确诊的上皮性卵巢癌患者，年龄29-75岁，平均（51.3±9.6）岁，粘液性囊腺癌8例，浆液性乳头状囊腺癌32例，粘液性

12、囊腺癌4例，透明细胞癌2例，子宫内膜样腺癌4例；FIGO分期：I期4例，II期12例，III期24例，IV期10例；分化程度：高分化12例，中分化16例，低分化22例。（2）良性组50例，为影像学及病理诊断为卵巢良性肿瘤者，年龄25-72岁，平均（47.6±8.8）岁；包括浆液性囊腺瘤28例，粘液性囊腺瘤22例。（3）健康组50例，为其它妇科疾病入院但经临床症状、影像学检查等未见卵巢异常者，年龄22-68岁，平均（45.8±9.1）岁。恶性组所有病例均为首发，术前均未行放、化疗、激素等癌症治疗。12方法121仪器与试剂FoxM1抗体由美国Santa Cruz公司生产，SP免

13、疫组化试剂盒由美国Invitrogen公司生产，DAB显色剂试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供，山羊抗兔免疫IgG二抗由上海合星生物科技有限公司提供，光学显微镜由日本Nikon公司生产，L XP100离心机由美国Beckman Coulter公司生产，UV754此外分光光度计由美国PerkinElmer公司生产，枸橼酸那缓冲液由21 g枸橼酸与29 g枸椽酸钠配比定容获得，PBS缓冲液由NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4配比获得。122免疫组化取病理组织石蜡标本连续切片，60过夜，二甲苯脱蜡，切片依次置入浓度100%、95%、80%和70%的乙醇溶液中浸泡3 min，PBS漂洗3次

14、，枸橼酸钠缓冲液浸泡，高压修复，PBS漂洗3次，加入0.3%过氧化氢甲醇溶液，置于室温下孵育15 min，加入山羊血清，置室温下封闭20 min，加FoxM1抗体，置室温下静置60 min，PBS漂洗。加山羊抗兔免疫IgG二抗，置室温下孵育20 min，PBS漂洗3次，DAB显色，自来水冲洗衣终止显色。SP免疫组化染色，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察样本。由于FoxM1主要于细胞核和细胞质中表达，因而可见细胞核及细胞质内有棕黄色颗粒者计为阳性。123FoxM1的表达 卵巢癌细胞的FoxM1剪接异构体表达情况采用免疫荧光法，分别将A2780、SKOV3、OVCAR3细胞接种于内有

15、10%的小牛血清的培养液中，于室温下置入5%的二氧化碳培养箱爬片培养48 h，PBS冲洗，加入4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，加入一抗置于4环境下过夜，PBS冲洗，加入二抗置于室温孵育1 h，PBS冲洗衣，显微镜下观察。13判定标准（1）染色强度评分：无目换染色为0分，染色强度高于背景且有淡黄色颗粒为1分，有明显浅黄色颗粒为2分，有较多深黄色颗粒为3分。（2）阳性细胞占比评分：随机取5个高倍视野，计算阳性细胞所占比例，低于5%者计0分，5%-25%者计1分，26%-50%者计2分，51%-75%者计3分，76%及以上者计4分。（3）综合评分：将染色强度评分与阳性细胞占比评分相加后进行综合评分，0

16、-1分计为阴性（-），2-3分计为弱阳性（+），4-5分计为中度阳性（+），6-7分计为强阳性（+）。14观察指标 评价不同组别患者FoxM1表达情况以及不同病理分型和临床分期的FoxM1表达情况。全部病例随访3-5年，对不同FoxM1表达的恶性肿瘤患者进行3年生存率（OS）和无进展生存率（PFS）。15统计学方法统计学处理采用软件SPSS21.0，三组间计数资料比较应用秩和（Kruskal-Wallis法）检验，如具有统计学意义，则进一步采用秩和（Nemeryi法）进行两两比较，当P<0.05时表示数据间比较差异具有统计学意义。2 结果21不同卵巢样本的FoxM1表达 如表1，恶性、良

17、性和健康组卵巢组织FoxM1的表达阳性率比较差异具有统计学意义（X2=62.632，P<0.01），两两比较，恶性组显著高于良性组及健康组（X2=27.473，60.864，P<0.01），良性组显著高于健康组（X2=10.187，P<0.01）。表1 三组卵巢组织的FoxM1剪接异构体表达情况统计组别例数-+阳性率恶性组50510171890%良性组5030182040%健康组504460012%22上皮性卵巢癌FoxM1表达特征 如表2和表3，不同临床分期的上皮性卵巢癌样本FoxM1的表达差异具有显著性，I、II期病变FoxM1阳性率显著低于III、IV期（X2=5.88

18、2，P<0.05）。但浆液性乳头状囊腺癌FoxM1阳性率与非浆液性乳头状囊腺癌比较差异无显著性（X2=0.039，P0.05）。表2 不同病理分型的上皮性卵巢癌卵巢样本中FoxM1表达分析病理分型例数-+阳性率浆液性乳头状囊腺癌3235121290.6%非浆液性乳头状囊腺癌18245788.9%表3 不同临床分期的上皮性卵巢癌卵巢样本中FoxM1表达分析临床分期例数-+阳性率I、II期16434575%III、IV期3416131497.1%23不同FoxM1剪接异构体表达的恶性组患者预后情况如表4可见，恶性肿瘤患者随着FoxM1表达增强，患者的OS和PFS逐渐下降。表4 不同FoxM1

19、表达的恶性组患者（例/%）组别例数OSPFS-55（100%）4（80%）+106（60%）4（40%）+178（47.1%）5（29.4%）+186（33.3%）2（11.1%）3 讨论卵巢癌在我国女性中患病率高、病死率高，尽管近些年来临床筛查手段不断进步，但由于卵巢癌早期较少见特异性症状，早期的诊断率仍然较低5。卵巢癌的早期诊断方法很多，包括对高危人群的筛查、肿瘤标志物的检测、影像学检查、细胞学试验、腹腔镜探查等，随着分子学研究的不断深入，基因组学和蛋白质组学也越来越受到重视6。FoxM1剪接异构体2010年被ISMCBBPR国际协会评为年度分子，被认为是恶性肿瘤分子学研究的重要因子。Fo

20、xM1基因在人类12p13-3号染色体位，主要存在a、b、c三种剪接方式7。在细胞周期中，FoxM1的表达具有周期性，一般于G0期呈低表达，G1期逐渐升高，至S期可到达峰值，并持续至M期，到达M期后可见迅速的降解8。王宇报道指出，FoxM1有多种生物学功能9：（1）细胞周期调控作用。FoxM1可诱导Cdc25A的表达及Cks1、Skp2的转录，从而促进具有细胞周期抑制作用的蛋白因子泛素化降解；也可对Cdc25B、Aurora B，PLK1、CENPA等细胞周期调控分子起到调节作用。（2）参与DNA损伤修复。Tan Y、Raychaudhuri P等利用siRNA对FoxM1表达进行干涉，发现其

21、可上调细胞周期抑制蛋白P21Cip1表达并激活p53，从而破坏DNA结构10。（3）参与细胞衰老机制。有研究发现，FoxM1表达水平下降可导致细胞的增殖速度减慢，并出现有丝分裂缺陷，可见FoxM1与细胞增殖与衰老有关11。（4）与器官形成、干细胞等密切相关。本组中对卵巢恶性肿瘤、良性肿瘤以及健康卵巢组织进行分组队列研究，发现FoxM1剪接异构体在三种卵巢组织样本中的表达呈现明显差异，尤其在恶性肿瘤的组织样本中FoxM1呈极高表达，阳性率可达90%，这与陈国庆等报道的卵巢癌病理组织FoxM1阳性率为89.71%十分接近12。FoxM1在卵巢阳性肿瘤中呈中等表达，占40%，而在健康卵巢中则呈低表达

22、，占12%，提示FoxM1可能参与卵巢病变的发生与发展中，甚至可能在其中产生一定的作用机制。国外一些报道已证实FoxM1为一种原癌基因，其在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、胰腺癌、胶质瘤等多种病变中均有高表达特征14，Priller M等认为FoxM1的高表达与恶性肿瘤的发生及预后均密切相关14。从预后方面评价，本组恶性肿瘤患者中FoxM1表达阴性者3年OS和PFS分别为100%和80%，FoxM1阳性表达的提高，患者OS与PFS逐渐下降，+患者的OS和PFS率仅为33.3%和11.1%，证实了FoxM1可能参与上皮性鸟巢癌的疾病进展过程，其机制可能与FoxM1对细胞周期的调控作

23、用及参与细胞衰老机制有关。本组中患者临床分期越高，FoxM1的表达阳性率越高，提示FoxM1可能参与到卵巢癌病变进展的过程当中。FoxM1通过细胞周期调控作用促进肿瘤细胞的增殖，最新研究发现其对细胞增殖的影响与细胞微管组织中心体相关蛋白Cep55密切相关。细胞缺乏Cep55后，细胞分裂的过程即停留于中间体阶段，出现胞质分裂障碍，而Waseem等的研究称Cep55为FoxM1的下游靶基因，由此可见，FoxM1还可通过对Cep55活性、转录与生长的影响来对肿瘤细胞产生影响，其对Cep55活性的影响主要通过Ras MAPK信号通路实现15。总之，FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中呈现为高表达，且随

24、着临床分期的增高FoxM1的阳性率提高，FoxM1可能参与卵巢癌的发生与进展过程，其机制可能与FoxM1的细胞周期调控作用有关。参考文献：1 马骏，王育. 活性氧在上皮性卵巢癌转移的相关性研究进展J. 中国实用妇科与产科杂志，2011，27（11）：862-865.2 李失颖，姜桦. ZEB家族在上皮性卵巢癌上皮-间质转化中的作用J. 国际妇产科学杂志，2014，41（1）：47-49.3 Paes MF，Dalto e RD，Madeira KP，et al. A retrospective analysis of clinicopathological and prognostic cha

25、racteristics of ovarian tumors in the State of Esp rito Santo，Brazil J. J Ovarian Res，2011，4（4）：14-18.4 Li YW，Qiu SJ，Fan J，et al. Intratumoral neutrophils: a poor prognostic factor for hepatocellular carcinoma following resection J. J Hepatol，2011，52（3）：497-505.5 金心，胡珍华，孙新宇，等. 转录因子NR4A2在卵巢上皮性肿瘤组织中的表

26、达及其临床意义J. 现代肿瘤医学，2013，21（12）：2775-2778.6 Bendoraite A，Knouf EC，Garg KS，et al. Regulation of miR-200 family micro RNAs and ZEB transcription factors in ovarian cancer: evidence supporting a mesothelial-to-epithelial transition J. Gynecol Oncol，2010，116（1）：117-125.7 Haslehurst AM，Koti M，Dharsee M，et al. EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer J. BMC Cancer，2012，12（12）：91-93.8 孙彦，李卓蔓，周淑娟，等. 卵巢癌患者外周血Foxp3+调节性T细胞的检测J. 中国医师进修杂志，2012，35（36）：26-29.9 王宇. FoxM1剪接异构体在上皮性卵巢癌中的表达及相关功能研究M. 第四军医大学博士学位论文，2013：30-35.10 Tan Y，Raychaudhuri P，Cost