分子生物学基础和技术教学大纲精

1、分子生物学基础和技术教学大纲（适用于医学检验和医学相关专业）课程性质与目的分子生物学是医学领域发展最快的学科之一，日新月异的技术使它逐渐成为医学发展的重要支柱。随着本世纪初人类基因组计划的完成，医学发展进入了一个全新的时代。疾病基因的不断发现和克隆，使人们对疾病的认识也不断深入，而这些重大的医学进步离不开技术上的更新和发展，生物芯片技术、基因测序技术、毛细管电泳技术等，每一次技术的进步都为分子生物学的发展提供了有力的保障。分子生物学技术是一门重要的基础和应用课程，教学方式目前主要以理论课程为主，分基础理论和基础技术两个部分，重点讲述分子生物学检验技术的基础理论和基础知识，并引入近年发展的新理论

2、、新技术，使学生了解和学习最新进展和相关内容。同时分子生物学技术最主要的作用是作为研究医学的一种媒介和工具，具有很强的实践性，其基本知识和理论来源于科学实验，因此现在现针对本科学生开展了分子生物学实验课程，实验教学是强化理论课的重要方式，是培养医学生实验科学概念和实验技能的重要途径，通过综合性的实验可以强化学生对理论的深入理解和实际运用，可以更全面直观的分析理论知识。更重要的是，实验教学是培养学生综合分析和解决问题的能力以及科学创新能力的重要方式。本课程的目的是通过分子生物学重要技术的学习，使学生掌握一门可运用于医学研究的技术和工具，了解医学发展的最新进展和前沿技术，通过理论与实践的结合将分子

3、生物学融入医学研究的各方面，分析疾病基因、从分子水平分析疾病发生的原因、跟踪疾病发展过程、检测感染人类的病原生物以及未来根据个体化治疗奠定理论和技术基础。课程的设置与要求本课程是在学生系统学习了前期课程的基础上由检验系临床化学教研室负责开设的，与本课程相关的基础课程有生物化学和生化技术等。本课程分为理论课程和实验课程两部分。理论课主要包括基础理论和基本技术，基础理论主要讲授基因和基因组、原核生物和真核生物基因组、人类基因组计划、蛋白质组学、肿瘤分子生物学等；基本技术包括了核酸提取、DNA重组技术、核酸干扰技术、核酸分子杂交、聚合酶链反应、DNA芯片等。实验操作可以使学生将晦涩的理论知识更加融会

4、贯通，因此针对本科学生选择性开设了实验课程基因重组实验，本实验是分子生物学技术的一个重要的技术平台，囊括了本门课程中众多的理论内容，如PCR、酶切、质粒提取、重组体构建等，是一个综合性实验。实验科共计17学时，连续三天完成。实验中要求学生按照相应的理论知识独立完成基因重组的各种技术和操作。通过实验教学，一方面使学生巩固所学理论，另一方面培养学生实践操作技能和方法，同时也训练了学生运用综合技能的能力。课程的组织与实施分子生物学技术课程教学在1个学期内完成，总学时为72学时，设定4个学分，安排在第三学年的第一学期。实验课将以分组进行，每组23人，由学生单独操作或分工操作完成实验内容。每位学生应客观

5、、真实、及时地记录实验结果，并按时完成实验报告。其中综合性实验要求学生在对理论教学教材与文献进行复习与查阅基础上，结合实验内容和实验指导，完成实验操作、观察和分析实验结果。课程的教材课程选用人民卫生出版社出版的分子生物学检验技术（第2版），实验课教材使用检验系自行编写的生物化学技术与分子生物学技术实验指导，建议将分子生物学检验技术习题集作为教学参考教材，科学出版社Molecular Biology(second edition),Gene VII和Molecular Cloning_A Laboratory Manual可以作为辅助外文教材。课程的理论课项目与学时数表一 教学理论时间安排讲授内

6、容讲授时数原核生物细胞基因组特点3学时真核生物细胞基因组特点3学时蛋白质组与蛋白质组学3学时肿瘤相关基因3学时核酸的分离与纯化6学时基因重组I 概述4学时基因重组II目的基因获得4学时基因重组III重组体的构建和筛选4学时基因重组IV原核基因表达的调控4学时基因重组V真核基因表达的调控4学时基因干扰技术4学时核酸分子杂交3学时聚合酶链反应及相关技术4学时生物芯片技术3学时分子生物学检验技术的临床应用3学时共计55学时表二 教学实验时间安排实验内容实验时数基因重组I感受态菌制备、转化反应6学时基因重组II重组体的筛选2学时基因重组III重组体的鉴定9学时共计17学时课程的考核与评分本课程考核采用

7、理论课程考试和实验课相结合的方式。其中理论课程考试占分数的90%，以期末考试方式进行，考试题型主要是名词解释（30%）、选择题（25%）、简答题（30%）和问答题（15%），实验成绩占10%，以每次实验课出勤、实验操作、实验报告相结合进行评分。教学内容理论课部分原核生物基因组【教学内容】1基因的概念：基因的生物学定义、基因的分子生物学定义、细胞基因组。2原核生物（细菌）基因组特点：生物种类、原核细胞和真核细胞内核酸含量、种类、功能的差异，操纵子结构。质粒概念、命名、分类，质粒的理化和生物学特性；转座子的概念、特点和生物学意义。大肠杆菌特点。3原核生物（病毒）基因组特点：重叠基因，DNA病毒（S

8、V40、HBV）和RNA病毒（HCV、HIV）等病毒的结构特点。【目的要求】掌握：1基因的分子生物学定义。2细菌基因组特点；操纵子结构；病毒基因组特点。 3质粒和质粒的特点。熟悉：1大肠杆菌、典型的DNA病毒和RNA病毒的特点。2转座子的特点和结构。真核生物基因组【教学内容】1细胞核基因组特点：单顺反子结构、断裂基因（外显子、内含子、间隔区DAN）、重复序列（单拷贝序列、中度重复序列、短分散片段、长分散片段、高度重复序列、反向重复序列、卫星DNA）、多基因家族和假基因、基因多态性（限制性片段长度多态性、单核苷酸多态性）、基因重叠、端粒。2细胞质基因组特点；线粒体基因组的结构和遗传特点。3基因结

9、构和人类疾病：染色体疾病（染色体数目异常、染色体结构异常）；基因结构与疾病（单基因疾病、多基因疾病）。4人类基因组与人类基因组计划：人类基因组计划和人类基因组计划的内容（遗传图谱、物理图谱、基因图谱、序列图谱）、功能基因组计划（功能基因组学、蛋白质组学、比较基因组学、环境基因组学、药物基因组学、基因组多态性、模式生物体基因组）。【目的要求】掌握：1真核生物基因组特点和与原核生物基因组的区别。2单顺反子结构、断裂基因、外显子、内含子、高度重复序列、SNP的概念。熟悉：1染色体疾病、单基因遗传病。2细胞质基因组特点。3人类基因组计划的内容。 蛋白质组与蛋白质组学【教学内容】1蛋白质组的概念和特点2

10、蛋白质组及其质点的分离与分析：蛋白质的分离纯化：蛋白质分离的材料选择；细胞破碎的方法；蛋白质混合物的分离方法；利用溶解度差异分离（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点法）；利用分子量不同分离（透析超滤、平衡离心、凝胶过滤层析）；利用电荷不同分离（电泳、离子交换层析）；亲和层析； 蛋白质分离纯化的条件：缓冲液、盐、还原剂、去垢剂、蛋白酶抑制剂、环境 蛋白质分析鉴定：Western印迹、二维电泳、放射性核素标记亲和标签法、蛋白芯片、质谱技术。3蛋白质和蛋白质的相互作用的研究方法（酵母双杂交、噬菌体展示、生物传感芯片质谱、蛋白质定点诱变）。4蛋白质和核酸相互作用的研究方法（凝胶滞后试验、滤膜结合法、甲基化

11、干扰实验、DnaseI足纹分析等）。5蛋白质的数据库。 【目的要求】掌握：1蛋白质组概念。2蛋白质分离纯化的方法。3二维电泳的原理。熟悉：1鉴定蛋白质与蛋白质相互作用的方法。2鉴定蛋白质与核酸相互作用的方法。 肿瘤相关基因【教学内容】1癌基因的概念、病毒癌基因、细胞癌基因特点。2主要的细胞癌基因、细胞癌基因的分类。3原癌基因激活的机制。4抑癌基因概念、重要的抑癌基因和抑癌基因失活的机制。5肿瘤转移相关基因：肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因。6肿瘤发生的机制。【目的要求】掌握：1癌基因概念和细胞癌基因分类。2原癌基因激活的机制。3抑制癌基因和抑癌基因失活机制。熟悉：1重要的细胞癌基因和抑癌基因。2

12、肿瘤转移相关基因。 核酸的分离与纯化【教学内容】1核酸分离和纯化的原则： 提取核酸的材料选择和原则、核酸的释放、核酸分离与纯化、核酸浓缩、沉淀和洗涤、核酸的鉴定方法（DNA和RNA，紫外分光光度法、荧光光度法）、核酸纯度鉴定（紫外分光光度法、荧光光度法）、核酸完整性鉴定（电泳法）、核酸的保存（DNA保存、RNA保存）。2基因组DNA分离与纯化：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法；DNA样品纯化。3DNA的回收：琼脂糖凝胶中回收DNA片段（DEAE纤维素膜插片电泳法；电泳洗脱法；低熔点琼脂糖凝胶回收法）；聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA；DNA提取的方法学评价。4质粒DNA的提取和纯化（碱裂解法、煮沸

13、法、SDS法）；质粒DNA纯化；质粒DNA的纯化和回收的质量保证和方法学评价。5RNA的抽提和mRNA的分离。【目的要求】掌握：1核酸提取的原则。2基因组核酸提取的方法（酚提取法）。3质粒提取的方法（碱裂解法）。4核酸的浓度测定和纯度的鉴定。5RNA和mRNA的提取。熟悉：1DNA回收和质粒回收、纯化。2DNA、RNA和质粒提取的方法学评价和质量保证。 基因重组I概述【教学内容】1重组DNA技术的定义及步骤。2重要的工具酶： 限制性核酸内切酶(命名、分类、11型限制酶的功能、应用及注意事项况）、DNA连接酶、其他常用工具酶（DNA聚合酶、Klenow大片段、TagDNA聚合酶、反转录酶、T4多

14、核苷酸激酶、碱性磷酸酶）。3主要的载体：克隆载体、表达载体、载体构建和选择的主要条件。4质粒载体（pBR322、pUC等）、噬菌体载体、SV40载体、穿梭载体、反转录病毒载体、人工染色体。【目的要求】掌握：1基因重组的主要过程。2限制性内切酶及其特点，星号活力 。3DNA连接酶的概念和作用。4克隆载体一般特点，主要的载体及其特点。 熟悉：1常用的分子克隆中的工具酶及其分子生物学作用。2噬菌体载体、Cos位点、穿梭载体。基因重组II目的基因的获得【教学内容】1获得目的基因的原理方法 构建 cDNA文库、筛选目的基因(真核 mRNA的分离纯化、反转录合成 cDNA、构建 cDNA文库、筛选目的基因

15、);构建真核细胞基因组文库筛选目的基因(分离纯化基因组DNA、DNA片段与载体的连接包装、导入细胞、筛选目的基因);人工合成目的基因DNA片段、聚合酶链反应合成DNA;其他方法。2获得目的基因方法的选择序列目的、特点、设备条件。3目的基因序列测定 测定的意义、目的基因测序方法(双脱氧链终止法、化学裂解法、自动测序仪法);长链 DNA测序的策略(随机法、嵌套缺夫法、引物延伸法）。【目的要求】掌握：1目的基因获得的方法。2双脱氧链终止法的原理。熟悉： 1基因组文库、cDNA文库、差示文库。2目的基因测序的方法。基因重组III重组体的构成、导入和筛选【教学内容】1重组体构建：目的DNA片段与载体连接

16、（粘性末端连接、平端连接、同聚体加尾连接）。2重组DNA分子导入宿主细胞：重组体DNA分子导入原核细胞为转化，CaCl2法、电穿孔法；重组DNA分子直接导入真核细胞为转染，电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体法、DEAE-葡聚糖介导转染、显微注射法；噬菌体或病毒将重组DNA分子导入细胞为感染。 3重组体筛选和鉴定：根据遗传学性状筛选（抗药性标志筛选、抗性标志插入失活筛选、互补筛选、标志补救筛选）；根据重组DNA分子生物学特征筛选（电泳、限制性酶切分析、PCR扩增、核酸分子杂交筛选）。 【目的要求】掌握：1重组体构建的方法。2转化、转染和感染的概念。3感受态细菌制备；CaCl2转化的原理。4重组体筛

17、选的方法；互补筛选的原理。熟悉：1真核细胞转染的方法及其优缺点。2目的片段与载体连接的方式。基因重组IV 重组体在原核宿主细胞中的表达与调控【教学内容】1基因表达概述、基因表达的概念、基本条件。2重组休在原核细胞中的表达的特点，操纵子结构等。3外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件，启动子、SD序列、增强子、终止子、p因子的概念和作用。4表达基因的分离与鉴定，包涵体（包涵体特点、包涵体分离纯化、包涵体复性等）。【目的要求】掌握：1原核细胞表达的调控元件，启动子、SD序列、增强子的概念和特点。2鉴定重组蛋白质的方法。熟悉：1半乳糖操纵子结构。2包涵体概念和处理。 基因重组V重组蛋白在真核细胞宿主

18、中的表达和调控【教学内容】1真核细胞表达调控元件：启动子、增强子、上游活性序列、终止序列、多聚腺苷酸尾、遗传标记等。2重组蛋白在真核细胞宿主中表达：非融合型表达蛋白、融合型表达蛋白和分泌型蛋白的特点。3 外源基因在真核细胞中的表达及鉴定：非融合型蛋白、融合型蛋白、融合型表达系统（His标签、GST、Ig-琼脂糖凝胶、氨基苯硫代半乳糖苷酶-琼脂糖凝胶等）、分泌型表达蛋白。4真核表达体系：酵母表达体系、哺乳动物表达体系（COS瞬时和稳定表达体系）。5重组蛋白在真核表达细胞中的分离和鉴定，Western等。【目的要求】掌握：1非融合型表达蛋白、融合型表达蛋白和分泌型蛋白的特点。2真核细胞表达调控元件

19、：启动子、增强子。熟悉：1融合型蛋白在真核细胞中表达系统。2哺乳动物表达体系。基因干扰技术【教学内容】1反义寡核苷酸技术：反义DNA技术原理；反义DNA的设计与合成；反义DNA的修饰；反义DNA进入方式。2反义RNA技术：反义RNA技术机制和设计。3核酶和脱氧核酶：核酶的分类、结构和设计；脱氧核酶结构、种类和催化特点；脱氧核酶设计原则。4小干扰RNA：siRNA作用机制（起始、效应和倍增阶段）、siRNA的设计原则、siRNA制备与合成（化学合成法、体外转录、RNaseIII消化、siRNA表达载体、siRNA表达框架）、 siRNA导入方法、RNA干扰效率的检测、RNA干扰的应用。5微RNA

20、：miRNA作用机制、miRNA与siRNA的区别、miRNA的作用。【目的要求】掌握：1siRNA作用机制；miRNA作用机制。2siRNA与miRNA之间的区别。3siRNA获得的方式。熟悉：1反义DNA原理与设计合成。2RNA干扰和miRNA应用。3siRNA设计及表达载体特点。核酸分子杂交【教学内容】1杂交基本原理、杂交分类，液相杂交、固相杂交（菌落杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交和狭缝杂交）、原位杂交、基因芯片技术。2探针设计与标记：核酸探针的分类、探针标记的方法（全程标记和末端标记）。3分子杂交过程：杂交各种介质的优缺点、预杂交的作用和成分、杂交的主

21、要过程 杂交信号检测的方法（放射自显影、显色、发光）。4核酸分子杂交技术的应用。【目的要求】掌握：1杂交的基本原理；融解温度。2分子杂交的分类和应用。3Southern印迹杂交的基本过程。熟悉：1分子杂交过程，影响探针杂交的因素。2探针标记的方法。3杂交信号检测的方法。聚合酶链反应及相关技术【教学内容】1PCR的概念、 PCR的原理（变性、退火、延伸）。 2PCR反应体系的组成成分（模板、缓冲液、dNTP、TaqE、引物等）和主要作用；PCR反应条件（温度、时间、循环次数）。3PCR技术的实验室质量控制：实验室规划设置、PCR技术质量保证。4PCR技术的相关技术（逆转录PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、差异显示PCR、PCR定点突变等）。 5PCR产物的检测（RFLP、ASO、SSCP、DGGE、融点曲线分析等）。6PCR在分子诊断中的应用（病原体检测、单基因遗传病、多基因遗传病、肿瘤、法医学等）。 【目的要求】掌握：1PCR原理。2PCR反应体系和反应条件。3逆转录PCR和定量PCR。4RFLP、SSCP检测PCR