初步探究影响尿生成因素及肾缺血再灌注的损伤机制

1、初步探究影响尿生成因素及肾缺血再灌注的损伤机制尚晓东1，韩忠宇，许晖阳1，卢沛根1，殷杰1， 苏达1(1.南方医科大学第二临床医学院临床医学五年制)指导老师：曾嵘2(2.南方医科大学基础医学实验教学中心，广州 510515)摘要：目的：加深理解尿生成的机理，初步探究缺血再灌注机制。 方法：分别观察正常情况下、IV.NS、IV.20%NS动脉血压，尿量和尿肌酐含量；复制肾缺血再灌注（I-R）模型，观测动脉血压、尿量和尿肌酐含量。结果：肾缺血再灌注后血肌酐浓度增高，尿肌酐浓度降低，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低。结论：肾I-R导致肾小球滤过能力下降，内生肌酐清除率下降。Abstract: Obj

2、ectives: To deepen the understanding of the mechanism of urine generated and explore the mechanism of ischemia-reperfusion .Methods: Under normal conditions, IV.NS, IV.20% NS arterial blood pressure, urine output and urine creatinine concentration; copy renal ischemia-reperfusion (IR) model, observi

3、ng arterial blood pressure，urine and urine creatinine concentration. Results: Serum creatinine concentration increased in the renal ischemia-reperfusion, while the urine creatinine concentration decreased, Ccr was significantly reduced. Conclusion: I-R leads to kidney glomerular filtration capacity

4、and the Ccrs decreasing.关键词：肾缺血再灌注 尿量 肌酐肾是机体主要排泄器官，内生肌酐清除率在一定程度上反映了肾脏排泄能力。尿生成主要包括肾小球滤过，肾小管和集合管的重吸收以及肾小管和集合管的分泌三个基本过程。肾缺血再灌注(ischemia - reperfusion , I - R) 损伤是临床上常见的病理过程,为急性肾功能衰竭的重要发病环节。因此探究理解肾I-R损伤机制对于临床有很大指导意义。本文旨在通过复制I-R损伤模型，尿生成和肌酐清除率来探究肾I-R对于尿生成的影响。1. 材料与方法1.1材料主要试剂与仪器：20%乌拉坦；0.2%肝素生理盐水；5%葡萄糖生理盐

5、水； 20%葡萄糖；速尿； PcLab生物医学信号采集处理系统；压力换能器；手术器械；动、静脉导管， 输尿管导管；恒温水浴箱分光光度仪，均由南方医科大学基础医学实验教学中心提供。肌酐测定试剂：试剂三，试剂四，10mol/L Cr标准品，由南方医科大学基础医学实验教学中心提供实验动物：家兔，体重2.5kg，由南方医科大学实验动物中心提供1.2 探究影响尿生成的因素120%乌拉坦5ml/kg耳缘静脉注射麻醉，分离右侧颈总静脉插管，补充5%葡萄糖生理盐 水30ml；分离左侧颈动脉插管监测血压；腹正中线剪开腹腔，行左侧输尿管插管术，用刻度试管收集并记录尿量。取尿0.5ml测量尿肌酐浓度。1.3 家兔肾

6、I-R模型复制1游离左侧肾动脉，用动脉夹夹闭20min，观察记录夹闭后动脉血压及尿量变化。松开动脉夹，记录15min尿量。对实验室不同实验组模型分别静脉输入NS 50ml、NS49ml+速尿1ml、NS40ml+20%GS 10 ml。观察15分钟记录尿量。1.4 尿肌酐测定方法 取样稀释：取尿液10ul与2ml蒸馏水按1:200比例稀释 加样配液:表1. 分光光度法测定尿液OD值各管加样方法加样（ml）标准管测定管空白管测试样品上清01.60试剂一(Cr标准品)1.600蒸馏水1.6试剂三0.5 0.5 0.5 试剂四0.5 0.5 0.5 1.4.3 测定：37 10min水浴加热，以蒸馏

7、水调零，测510nm时吸光度1.4.4 计算：肌酐（mol/L）=(测定灌OD-空白管OD)/（标定管OD-空白管OD）×标准品浓度×201倍1.5 计算内生肌酐清除率 Ccr=尿肌酐浓度/血肌酐浓度×尿量（ml/min）2. 实验结果2.1 血压记录夹闭肾动脉后，动脉血压略有下降，再灌注后，动脉血压回升表2. 家兔肾I-R模型中动脉血压记录动脉血压正常缺血15min再灌注后10min收缩压(mmHg)99.86087.965100.845舒张压(mmHg)84.11461.96787.5952.2尿量记录2.2.1缺血再灌注后，未施加因素时，尿量明显减少；IV

8、50ml生理盐水后，尿量回升表3 肾I-R后IV 50ml NS 尿量的变化正常再灌注15min(未施加因素)再灌注（IV NS50ml）尿量(ml/min)0.2400.0600.1412.2.2 缺血再灌注后，IV生理盐水+速尿后，由于实验操作问题，本实验室未获得有效数据2.2.3 缺血再灌注后，IV生理盐水+20%葡萄糖，尿量相对正常情况略有减少 表4 肾I-R后 IV20%GS+NS 尿量的变化正常缺血再灌注15min（IV 20%GS+NS）尿量(ml/min)0.02250.0152.3血浆，尿液肌酐含量记录表5.各管OD值及尿量记录标准管OD值空白管OD值测定管OD值尿量正常再灌

9、注15min(未施加因素)正常再灌注15min(未施加因素)0.0910.0600.0840.0720.2400.060经数据处理可知，缺血再灌注后，尿肌酐浓度明显下降，血肌酐浓度明显上升表6 肾I-R 血、尿肌酐浓度的变化 正常缺血再灌注15min(未施加因素)尿肌酐浓度（mol/L）1685.81778.06血肌酐浓度（mol/L）152.30175.60umol2.4 内生肌酐清除率计算缺血再灌注后，肾脏肌酐清除率明显下降表7 肾I-R 肾内生肌酐清除率的变化正常缺血再灌注15min（未施加因素）Ccr(ml/min)2.660.273. 讨论3.1 影响尿生成的因素 在本实验中，缺血再

10、灌注后，静脉快速注入大量0.9%NaCl 溶液，尿量比未施加因素时增加。机制如下：1).V 大量NS后，血浆蛋白被稀释，血浆胶体渗透压下降，肾球有效滤过压增加，肾小球血浆流量也增加，肾小球滤过率增加，尿量增多2；2）.注入大量0.9%NaCl 溶液后血容量增加，抑制抗利尿激素的分泌，导致远曲小管和集合管上皮细胞对水的重吸收减少，使得尿量增多。3 静脉注射高渗葡萄糖，使肾I-R家兔尿量回升。原因是近曲小管对葡萄糖的重吸收存在一定限度，即肾糖阈。本实验中，注射高渗葡萄糖后血糖浓度已经超过肾糖阈，导致小管液中有部分葡萄糖没有被重吸收，使小管液中溶质浓度增加，渗透压增加，妨碍了肾小管尤其是近曲小管对水

11、的重吸收，导致尿量增加。4 静脉注射速尿，速尿可与髓袢升支粗段的Na+- 2Cl- K+同向转运体结合，由于NaCl 的重吸收被抑制，降低了肾髓质的高渗梯度，从而使肾脏浓缩尿液的能力下降，导致水重吸收减少，尿量增加，产生明显利尿效果。53.2 肾缺血再灌注损伤机制 活性氧机制6活性氧产生机制：肾缺血20min，肾脏供血供血供氧不足，再灌注供养时，提供大量电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多。1）缺血时线粒体呼吸链传递电子的效能下降，不能产生足够电子，自由基生成增加；再灌注提供大量氧气，就会产生大量大量活性氧；2)血管内皮细胞内XO形成增加，进而在次黄嘌呤氧化途径中产生活性氧增加；3）白细胞

12、呼吸爆发产生大量活性氧；4）儿茶酚胺自身氧化；5）诱导NOS表达合成；6）加上再灌注后体内清除活性氧的能力下降，导致组织内大量活性氧的产生。活性氧的损伤作用：膜脂质过氧化，蛋白质失活，DNA损伤7，细胞间机制破坏等都造成肾脏组织细胞损伤，肾小球滤过能力和肾小管重吸收能力均下降，进而导致内生肌酐清除率下降。 钙超载机制8钙超载产生机制：1)缺血造成细胞膜对钙的通透性增加，再灌注时，大量钙离子顺浓度梯度进入细胞内；2）缺血缺氧，细胞内PH下降，钠-氢交换增加，进而促进钠-钙交换反转，使胞外钙离子大量内流；3）儿茶酚胺增多，促进细胞内钙库释放钙离子。钙超载损伤机制：1）线粒体通透性转运孔道开放，诱发

13、细胞凋亡9（已证明与细胞色素C相关性很大）；2）线粒体释放钙离子，使胞内钙浓度剧烈升高，激活各种钙依赖性蛋白酶、磷脂酶、核酸内企鹅们等，造成细胞膜、细胞骨架、核酸分解，导致细胞损伤；3）钙超载促进活性氧生成白细胞作用10缺血期产生的代谢产物蓄积，组织细胞碎片等可触发急性炎症反应，再灌注时白细胞随血流进入组织加剧了炎症反应。白细胞活化后释放的趋化因子促使更多白细胞聚集，引起微循环障碍；聚集的白细胞释放活性氧和各种生物活性物质，使验证反应失控，并导致组织损伤。 高能磷酸化合物合成障碍肾脏缺血时，细胞合成ATP的能力在灌注后很长时间内才能恢复。机制为：线粒体损伤以及ATP合成的前体物质如腺苷，次黄嘌

14、呤等在再灌注时被冲洗出去，进而使缺血组织失去再合成高能磷酸化合物的能力或能力减弱。参考文献 1 金春华. 机能实验学M. 科学出版社,2006. 2 李雪飞，成春英，张天杰，等. 影响尿生成的因素综合性实验的改革J. 湘南学院学报,2005(01). 3 温敏霞，王黎明，覃莉. 家兔尿生成的影响因素及其作用机制分析J. 科教文汇(上旬刊),2010(03). 4 姚萍，李云义，刘焕珠，等. 大鼠用于尿生成影响因素的实验研究J. 第四军医大学吉林军医学院学报,2003(02). 5 朱顺法，徐立松. 新袢利尿药:托拉塞米J. 医药导报,1995(03). 6 肖献忠. 病理生理学M. 第二版. 高等教育出版社. 7 余晓东，崔曙，邓显忠等. 细胞核因子kappa B p50蛋白在肾缺血再灌注损伤中的表达及意义J. 四川医学,2010(10). 8 Wong R, Steenbergen C, Murphy E. Mitochondrial permeability transition pore and calcium handlingJ. Me