RNAi沉默COX-2对HSC细胞动力学及脂质代谢的影响

1、RNAi 沉默 COX-2对 HSC细胞动力学及脂质代谢的影响第一章 COX-2基因 shRNA干扰载体的构建及抗肝纤维化作用目的构建COX-2shRNA真核表达载体，并观察其抗肝纤维化作用。 方法 1. 分别从 TRCshRNA、origeneshRNA数据库中选取 1 条大鼠 COX2基因及 2 条人 COX2基因序列，分别构建 3 个 COX-2ShRNA真核表达载体，进行酶切鉴定和测序；2. 脂质体介导重组质粒转染 HSC-T6细胞株 , 荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测 COX-2mRNA表达 ,Western-Blot检测 COX-2蛋白质表达； 3.SD 大鼠尾静脉注射腺

2、病毒介导的重组质粒体内转染； 12 周末 , 处死大鼠； RT-PCR检测肝组织 COX-2mRNA表达 , 免疫组织化学检测肝组织COX-2蛋白质表达 , HE、MASSON染色分析纤维病变程度 , 图像分析仪测量肝组织纤维病变面积。结果1. 酶切、测序、比对显示，COX2-shRNA-1,2,3序列成功插入目的载体，且序列完全正确；2. 荧光显微镜观察显示 COX-2shRNA1、COX-2shRNA2、 COX-2shRNA3转染效率均在 70%以上；3.RT-PCR和 Western-Blot检测证实 , 转染后 COX-2shRNA1,2,3均可抑制 HSC-T6细胞株 COX-2基

3、因的表达 , 但抑制程度不一 , 其中 COX-2shRNA-1组抑制作用最明显； 4. COX-2shRNA-1SD大鼠体内转染 , RT-PCR 和免疫组织化学检测证实 ,COX-2shRNA1可抑制 COX-2基因表达及纤维化组织增生。结论 1. 成功构建 COX-2基因 shRNA干扰载体； 2. COX-2shRNA1，2，3 具有抑制 HSC-T6细胞 COX-2表达作用，其中COX-2shRNA-1抑制作用最为明显； 3.COX-2shRNA1具有抑制 SD大鼠肝组织 COX-2表达的作用； 4. COX-2shRNA1具有抑制 SD大鼠肝纤维化作用。第二章 RNAi 沉默 CO

4、X-2对 HSC基因表达谱的影响目的研究 COX-2shRNA1沉默肝星状细胞COX-2后，HSC基因表达谱的变化。 方法 1.实验分为 COX-2shRNA1组、HK组（空载体组）；2.Trizol法提取 HSC中的总 RNA。纯化 mRNA,两组 mRNA分别逆转录合成荧光标记的cDNA混合物探针； 3. 荧光标记的 cDNA混合物探针，与 27K Rat Genome Array 杂交，经严格洗片后，用GenePix40OOB扫描仪扫描芯片荧光信号图像，计算机软件数据处理，将所得的数据进行比较， 得到二者间基因表达的差异信息。结果 1. 按 Ratio 值 1.5 和0.667 标准 ,

5、 沉默 COX-248小时、 72 小时后， HSC分别有 45 个和 93 个基因出现差异性表达； 2. 按 Ratio 值 2.0 和 0.5 标准 , 沉默 COX-248小时、72 小时后，HSC分别有 12 个和 23 个基因出现差异性表达； 3. 沉默 COX-2后 , HSC-T6差异表达基因主要与生物学过程（48 小时、 72 小时分别为 54.32%,44.29%）、分子功能（ 48 小时、 72 小时分别为 32.10%，37.14%）有关。结论 1. COX-2shRNA1沉默COX-2后 HSC基因表达谱发生变化； 2. COX-2shRNA1沉默 COX-2后差异表达

6、基因主要与生物学过程、分子功能有关。目的研究 COX-2shRNA1沉默肝星状细胞COX-2后，肝星状细胞脂肪代谢的变化 , 验证基因芯片筛选的与脂代谢密切相关的差异表达基因。第三章RNAi 沉默COX-2对 HSC细胞动力学及相关基因表达的影响目的研究COX-2shRNA1沉默肝星状细胞 COX-2后，肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化, 验证基因芯片筛选的与细胞动力学密切相关的差异表达基因。方法 1.MTT法检测细胞体外增殖活力；2. 流式细胞术检测 HSC-T6凋亡及细胞周期； 3.RT-PCR法和 Western blot 法验证细胞动力学密切相关的差异表达基因。结果 1. 与空白对

7、照组（ NC）和空载体（ HK）组相比，转染pYr-1.1-hU6-EGFP-COX2-shRNA1质粒， 48h 细胞凋亡率明显增加 (P <0.01)；2.72h 后 HSC-T6细胞的增殖出现明显的抑制作用(P<0.05)； 3. COX-2shRNA1组 G1%相较 NC组和 HK组的 G1%增高；4.RT-PCR验证显示 Cdc27、Sh3kbp1 表达增加 , Plcd4表达减弱 , 其余统学处理没有显著意义。结论1.COX-2shRNA1能够抑制 HSC-T6细胞体外增殖；2.COX-2shRNA1能够促进 HSC-T6凋亡；3.COX2ShRNA1可

8、能在 G0/G1期阻滞细胞周期； 4. RT-PCR验证显示 Cdc27、Sh3kbp1 表达增加 ,Plcd4 表达减弱。方法1. 高效液相色谱法（ HPLC）检测 24 小时、 48 小时、 72小时各组细胞内甘油三酯、胆固醇、维生素A 含量； 2.RT-PCR检查验证脂代谢差异表达基因。结果 1.COX-2ShRNA1组细胞内甘油三酯的含量随着时间的延长逐渐增加（ F=34.524,P=0.000 ）, 各时间段的空载体组与空白对照组比较，细胞内甘油三酯含量存在显著差异 （均 P<0.05 ）；2.COX-2ShRNA1组细胞内胆固醇的含量随着时间的延长逐渐降低 （F=360.808,P=0.000 ）, 与各时间段的空载体组与空白对照组比较，细胞内胆固醇含量存在显著差异（均 P<0.05 ）；3.COX-2ShRNA1组细胞内维生素A 的含量随着时间的延长逐渐增加（F=19346.057,P=0.000 ）,各时间段的空载体组与空白对照组比较，细胞内维生素 A 含量存在显著差异 （均P<0.05）；4. R