PKM2对谷氨酰胺代谢和线粒体损伤的调控机制及白藜芦醇的干预作用

1、PKM2对谷氨酰胺代谢和线粒体损伤的调控机制及白藜芦醇的干预作用为应对缺氧和低营养条件的肿瘤微环境, 肿瘤细胞往往发生能量代谢的改变,即“代谢重编程”。主要表现在两个方面 : 有氧糖酵解和对谷氨酰胺的高度依赖。肿瘤细胞通过代谢重塑为其生物合成提供大量的中间代谢产物, 表明代谢重编程在肿瘤恶性转化过程中举足轻重的作用。肿瘤细胞的葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢途径均受到复杂的信号转导途径的调控, 因此探讨这两种代谢途径间的调控关系及其产生原因 , 将为以肿瘤代谢为靶点的肿瘤治疗提供理论基础。近年来 , 随着人们对肿瘤细胞能量代谢重塑的深入研究, 发现 M2型丙酮酸激酶 (M2 type pyruvate

2、 kinase,PKM2)在糖酵解过程中扮演着关键角色。PKM2是糖酵解途径中将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成为丙酮酸和ATP的限速酶。已知 PKM2在肿瘤细胞中特异性高表达, 在协调肿瘤细胞葡萄糖相关代谢途径 ( 包括糖酵解、磷酸戊糖和丝氨酸合成途径 ) 中发挥关键作用 , 但 PKM2是否参与谷氨酰胺代谢及线粒体功能调控却鲜为人知。本研究探讨了 PKM2与谷氨酰胺代谢及线粒体功能调控之间的关系 , 并对其分子机制进行深入研究 , 为以代谢为靶点的肿瘤治疗提供新思路 ; 进一步以 PKM2作为肿瘤治疗的靶点 , 探讨了白藜芦醇对 PKM2的干预作用及分子机制 , 同时拓展了白藜芦醇的药用价

3、值。本研究获得的主要研究结果如下 :(1) 探讨 PKM2与谷氨酰胺代谢之间的关系及其分子机制。研究结果表明 ,PKM2稳定敲低能够增加谷氨酰胺酶 Gls1 、Gls2,谷氨酰胺转运受体SLC1A5及其上游转录因子 -catenin 、c-Myc 的表达 , 而 PKM2过表达可抑制其表达 , 表明 -catenin/c-Myc信号通路介导 PKM2对谷氨酰胺代谢的调控。放线菌素 D实验显示 ,PKM2上调 -catenin的表达主要是通过调控其转录水平 , 而不是通过抑制 mRNA降解。检测 PKM2不同点突变细胞株中 -catenin 的表达 , 发现 R399E突变细胞能明显抑制 -ca

4、tenin 的表达 , 即二聚体形式的 PKM2发挥关键作用。PKM2过表达上调 miR-200a 的表达 ,miR-200a 可与 -catenin 的 3 UTR结合抑制 -catenin 的表达。 (2) 探讨 PKM2与线粒体功能之间的关系。采用线粒体探针标记 PKM2过表达及敲低的细胞中的线粒体 , 显微镜观察发现 PKM2过表达的细胞中线粒体围绕细胞核分布 , 融合线粒体的比例升高 , 线粒体数量减少。而 PKM2敲低后 , 线粒体分裂为更小的单位 , 数量增多。qPCR和 western blot 结果显示 PKM2过表达后 , 线粒体分裂蛋白 Drp1 表达减少 , 融合蛋白

5、Mfn2 表达升高 ;PKM2敲低后 ,Drp1 表达升高 ,Mfn2 表达降低 ; 同时 ,PKM2过表达导致 ATP生成量减少 , 线粒体 DNA拷贝数增加 , 电子传递链复合物的表达下降。 (3) 探讨 PKM2通过 Drp1 调控线粒体动态平衡的分子机制。研究结果显示 PKM2过表达能够在蛋白水平抑制 p53 表达 ,PKM2敲低促进其表达 , 而对 p53mRNA水平没有影响。采用 p53 siRNA 处理细胞后 ,Drp1 随 p53 表达的下降而下降 , 表明 PKM2能够通过 p53 调控 Drp1 的表达。蛋白稳定性实验提示 ,PKM2过表达促进了p53 通过蛋白酶体途径降解

6、 , 而PKM2敲低可增加 p53 蛋白的稳定性 , 该过程是通过 MDM2介导的 p53 泛素化实现的。免疫共沉淀及GST pull-down 实验表明 ,PKM2与 p53、 MDM2存在相互作用 ,推测 PKM2与 MDM2可结合到 p53 不同的结构域形成三元复合物促进p53 的泛素化 ,进而通过蛋白酶体途径被降解。免疫组化检测宫颈癌病人临床样本中PKM2和 Drp1 的表达 , 结果显示 PKM2与 Drp1 的表达呈负相关 , 这与细胞水平得到的结果是一致的。 (4) 探讨 PKM2通过Mfn2 调控线粒体动态平衡的分子机制。研究表明 PKM2过表达能够抑制miR-106b 的表达

7、。双荧光素酶报告实验显示miR-106b 可以直接靶向 Mfn2 3 UTR,进而抑制 Mfn2 的表达。采用 miR-106b 模拟物转染细胞后 , 发现 Mfn2的表达水平显著降低 , 融合线粒体的数量及 mtDNA拷贝数减少 ,ATP 生成量升高。免疫组化检测乳腺癌病人临床样本中 PKM2和 Mfn2 的表达 , 结果显示 PKM2与 Mfn2 的表达呈正相关 , 这与细胞中所得结果是一致的。(5) 探讨白藜芦醇对 PKM2的干预作用及分子机制。 研究发现白藜芦醇能够通过靶向抑制 PKM2的表达发挥其抗肿瘤活性。白藜芦醇处理后导致线粒体分裂成更小、 更多的线粒体 , 且 Drp1 和 F

8、is 表达明显升高 ,Mfn2 的表达显著下降 ,PKM2过表达可逆转这一现象 ; 另外 , 内质网应激的关键分子 GRP78、CHOP和 Caspase12显著上升 ,PKM2过表达后其表达明显逆转。检测 PKM2敲低的稳定细胞株中上述指标的表达 , 发现内质网应激指标及线粒体分裂蛋白表达上调 , 线粒体融合蛋白表达下降。以上结果表明 PKM2介导的内质网应激和线粒体分裂参与白藜芦醇诱导的细胞凋亡。双荧光素酶报告实验显示 miR-326 可直接与 PKM2的 3UTR结合 , 进一步实验结果表明白藜芦醇能够通过上调miR-326 有效抑制 PKM2的表达。综上所述 :PKM2缺失可通过激活 -catenin/c-Myc信号通路促使谷氨酰胺代谢发挥代偿作用。 PKM2一方面通过 p53/Drp1 轴抑制线粒体分裂 , 另一方面通过 miR-106b/Mfn2 轴促进线粒体融合 , 最终引起线粒体过度融合、功能受阻。白藜芦醇可通过上调miR-3