荧光寿命测定方法（课堂PPT）

1、荧光寿命的测定方法荧光寿命的测定方法2013-9-26 一、荧光寿命的概念一、荧光寿命的概念二、测定荧光寿命的几种方法二、测定荧光寿命的几种方法三、时间相关单光子计数方法三、时间相关单光子计数方法TCSPC四、四、TCSPC技术优缺点技术优缺点五、荧光寿命测定中可能存在的问题五、荧光寿命测定中可能存在的问题 激光(Laser)的全名是“光的受激辐射放大”。(Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation)一、荧光寿命的概念一、荧光寿命的概念E1E2E3E4hE1E2E3E4(10-8s)(10-3s) 一、荧光寿命的概念一、荧光寿

2、命的概念自发辐射：处于高能级E2的原子自发地向低能级E1跃迁，并发射出一个频率为=（ E2- E1 ）/h的光子。自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值A21=(dn21/dt)sp/n2 一、荧光寿命的概念一、荧光寿命的概念自发辐射跃迁的过程是一种只与原子本身的性质有关，与辐射场无关的自发过程。A21的大小与原子处在E2能级上的平均寿命2有关。E2能级上的粒子数密度n2随时间的变化率dn2(t)/dt=-(dn21/dt)sp=-A21n2(t)n2(t)= n2(0)e -A21n2(t)定义粒子数密度由t=0时的n(0)衰减到

3、它的1/e时所用的时间为E2能级的平均寿命。=1/A21 一、荧光寿命的概念一、荧光寿命的概念假定一个无限窄的脉冲光(函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为和knr ,则激发态衰减速率可表示为d n ( t)/d t= - ( + knr ) n ( t)其中n ( t) 表示时间t 时激发态原子的数目,由此可得到激发态物质的单指数衰减方程。 n ( t) = n0 exp ( - t/) 式中为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改写为:I ( t) = I0 exp ( - t/) 其中I0 是时间

4、为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: = ( + knr ) - 1 也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物质在测定条件下的荧光寿命。 二、测定荧光寿命的几种方法二、测定荧光寿命的几种方法荧光寿命测定的现代方法主要有以下几种：时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting ，TCSPC) 频闪技术(Strobe Techniques)相调制法(Phase Modulation Methods) 条纹相机法(Streak Cameras) 上转换法(Upcon-version Methods) 三

5、、单光子计数方法三、单光子计数方法单光子计数技术，是检测极微弱光的有力手段，这一技术是通过分辨单个光子在检测器（PMT）中激发出来的光电子脉冲，把光信号从热噪声中以数字化的方式提取出来光电倍增管(PMT)是一种高灵敏度电真空光敏器件，主要包括以下几个部分：光窗：光线或射线射入的窗口璃；光阴极：这是接受光子产生光电子的电极；倍增极：管内光电子产生倍增的电极，倍增极的数目有813个，一般电子放大倍数达106-109；阳极：经过多次倍增后的电子被阳极收集，形成输出信号。 三、单光子计数方法三、单光子计数方法荧光的发射是一个统计过程，很少有荧光分子刚好在（荧光寿命）时刻发射荧光，荧光寿命仅反映荧光强度

6、衰减到其起始值1/e所需的时间。在被测的微弱随机光场作用下，光检测计光阴极发射光电子，其行为可用双随机泊松点过程来描述，光电子时间统计特性可用多重概率密度求平均来得到式中：tjtotj0得到光检测方程（t） I（t）式中： 是比例系数。说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。 三、时间相关的单光子计数方法三、时间相关的单光子计数方法TCSPC降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样品时或者仅有个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射个光电子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：Pf(t) = I（

7、t）只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区间的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。 三、时间相关单光子计数方法三、时间相关单光子计数方法TCSPC时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光寿命的测量。 四、四、TCSPC技术优缺点技术优缺点 TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小,是目前最流行的荧光寿命测定方法；实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)；对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光电子同时到达的概率；这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。 五、荧光