Actin调控激酶MoArk1结合蛋白MoCAP和MoAbp1在稻瘟病菌发育和致病中的功能分析

1、Actin调控激酶 MoArk1结合蛋白 MoCAP和 MoAbp1在稻瘟病菌发育和致病中的功能分析稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)引发的水稻稻瘟病是重要的水稻病害之一,易暴发成灾 , 该病害在水稻的整个生育期内都会发生, 其流行程度因不同区域和不同年份而具有一定的差异, 平均每年给全世界的水稻生产造成10%20%的损失。该病害也是我国各水稻种植区重要的病害之一, 正危害我国水稻的生产安全。目前 , 对该病害的防治仍以筛选培育抗病品种和化学药剂为主, 但是由于该病原菌容易发生变异 , 抗病品种抗病性会随新的致病群体的形成而迅速丧失, 而化学药剂的常年使用也会导致抗药性群体产生

2、, 导致药剂失去防治效果 , 因此 , 对于该病害的控制一直是水稻生产上一个亟待解决的重要问题, 而控制稻瘟病菌危害的一个重要前提就是要了解其致病机理, 这一问题的解决将对该病害的治理与控制具有重要的理论与实践意义。 本实验室前期研究发现肌动蛋白actin细胞骨架调控激酶 MoArk1通过调控 actin细胞骨架的组装 , 细胞内吞作用 , 顶体的形成参与调控稻瘟病菌的生长, 产孢及致病力。本论文主要对 actin调控激酶 MoArk1 的三个结合蛋白 MoCapA、MoCapB和MoAbp1在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能进行分析, 研究结果如下 : 为了进一步研究 MoArk1及 ac

3、tin 细胞骨架在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能,本文通过 Co-IP 筛选了稻瘟病菌中与MoArk1互作的蛋白 , 并对亲和纯化筛选到的F-actin加帽蛋白 MoCapA和 MoCapB与 actin细胞骨架调控激酶MoArk1的互作关系进行了验证 , 结果证明它们是相互作用的。MoCapA和 MoCapB分别是 actin加帽蛋白复合体的 亚基和 亚基 ,MoCapA具有两个 actin加帽基序 ,MoCapB具有一个 actin加帽基序。通过基因敲除获得了MoCAP和 MoCAPB的缺失突变体及 MoCAPA和 MoCAPB的双缺失突变体 , 与野生型菌株 Guy11相比 , 突变

4、体的生长显著减慢 ; 产孢量显著下降 , 孢子形态异常多样 , 而缺失 MoCAPA或 MoCAPB和同时缺失 MoCAPA和 MoCAPB的表型是相同的 , 说明 actin加帽蛋白复合体缺失了任何一个亚基都会使整个复合体的功能丧失。同时发现, 突变体中 actin细胞骨架组装异常 , 有丝分裂减慢 ,胞吞作用延迟 , 效应分子的分泌异常 , 细胞自噬作用延迟。MoCAP与 actin相互作用 , 与 actin共定位 , 调控 actin细胞骨架的组装。 进一步地对 MoCAP的 actin加帽基序进行缺失突变并进行表性分析发现,actin加帽基序缺失突变体的生长, 孢子形态 , 致病力与

5、 MoCAP缺失突变体的相同 , 而MoCAP的定位由原来的actin定位模式变成了充满细胞质, 而且缺失 actin加帽基序后 MoCAP不能与 actin.互作 , 表明 MoCAP通过 actin细胞骨架调控多个细胞生物学过程参与调控稻瘟病菌的生长、产孢及致病过程。进一步研究发现 ,MoArk1 能够通过磷酸化MoCapA的第 85 位的丝氨酸 ,MoCapB的第 285 位的丝氨酸调控 MoCapA和 MoCapB的功能。 MoCAP能够响应PIP2 的水平调控 actin细胞骨架的组装。以上结果表明 MoCAP对于稻瘟病菌细胞骨架的组装, 多个细胞生物学过程及致病力都是非常重要的 ,

6、 且其功能受到 MoArk1 和 PIP2 的调控。对亲和纯化筛选到的 actin结合蛋白 MoAbp1与 MoArk1 的互作关系进行了验证 , 结果证明它们是相互作用的。MoAbp1具有三个结构域 , 分别是 ADFH结构域和两个 SH3结构域。通过基因敲除获得了 MoABP的缺失突变体 , 表型分析发现 MoABP1缺失突变体生长减慢 , 致病力下降。同时 ,MoABP1缺失突变体 actin细胞骨架组装异常 , 胞吞作用延迟。进一步研究发现 MoAbp1参与调控 MoArk1的亚细胞定位和自我磷酸化, 同时参与调控环化酶相关蛋白 MoCap1的定位 , 影响 cAMP的合成。通过酵母双杂交实验发现,MoAbp1能够通过 ADFH,F-SH3,E-SH3分别与MoAct1,MoArk1,MoCap1互作 , 而 MoAbp1与 actinpatches 共定位依赖于 ADFH功能域 , 但 MoAbp1的每个功能域对于其正常的功能都是不可缺少的。总之,MoAbp1作为一个接头蛋白将MoArk1 和 MoCap1招募到 actin细胞骨架上 , 调控 actin细胞骨架的组装、胞吞过程进而控制稻瘟病菌的生长发育及致病过程。综上所述 ,actin细胞骨架的组装在稻瘟病菌