第四部分A280A260法测定蛋白质浓度

1、第四部分 A280/A260法测定蛋白质浓度目前在生物化学实验中有几种测定蛋白质浓度的方法：280nm/260nm（A280/A260）光吸收法，Bradford检测法，Lowry检测法和二喹啉甲酸（BCA）检测法，通常根据蛋白质样品量大小，蛋白纯度等因素选择不同的测定方法。本实验只需对层析洗脱峰进行快速而粗略的定量分析，因此选择A280/A260光吸收法。一、原理由于蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构的氨基酸，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其吸收值与蛋白质浓度成正比，故可用波长吸收值大小来测定蛋白质含量，但由于此方法无法排除核酸的干扰，因而在通常情况下还要测定样品在2

2、60nm处的OD值（光吸收值）。二、提要1. 所需时间：几分钟2. 优点：方便、快速，且对蛋白质无破坏性，测定后的蛋白质仍能回收利用。3. 缺点： 1）准确度较差，不是严格的定量，因为此法是根据酪氨酸（Tyr），苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）残疾的强吸收值来测定的。不同蛋白质有不同的消光系数，如果一种蛋白质中没有上述三 种氨基酸残基，用此法则不能检出。 2）核酸可引起强干扰作用4.灵敏度：0.05mg/ml2mg/ml；比色杯的最小测量体积为0.1ml三、设备和试剂1. 设备1）紫外可见分光光度计；2）石英比色杯；3）滤纸；4）擦镜纸；5）用于溶液转移的吸管或移液枪2. 试剂实验用缓冲液

3、四、操作步骤将实验缓冲液加入比色杯中，将A280（或A260）值调零，再吸去缓冲液对照加入样品，记录A280和A260值；三次求平均值。五、注意事项1. 实验室中常犯的错误是认为用1cm的比色杯所测吸收值为1.0时，蛋白质浓度大约为1mg/ml，这是非常不精确的；2. 玻璃和塑料在紫外吸收光范围内本身就具有光吸收值，因而不能用来进行蛋白质的定量如果所测值超过测量范围（A280示数显示在0.12.0为宜），应将样品用缓冲液稀释后再测量。3. 如果实验所用的缓冲液和水相比有较高的光吸收值，这说明缓冲液有干扰物质存在。4. 修改测定方法可部分改正由于干扰物质和蛋白质组成不同所引起的误差，最常用的是检

4、测A280/A260的比值，通常： 纯蛋白质的光吸收A280/A260值为 1.8 纯核酸的光吸收A280/A260值为 0.5蛋白质溶液的A280/A260值如为2.0，这时可忽略溶液中核酸的光吸收值，否则视为含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，再用以下经验公式，即可计算出蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.5×A280-0.75×A2605. 由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH变化而改变，故应用此法时要注意溶液的pH。最好样品的pH与标准曲线制定时的pH一致。第五部分 凝集素的糖抑制试验一、原理细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖

5、分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。凝集素（Lectin）是一类能够专一性，可逆性地与糖结合的蛋白质或糖蛋白，它具有凝集细胞刺激细胞分裂的作用。由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成桥的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制该凝集素对细胞的凝集。不同凝集素有其特异性结合的糖的类型，在此，我们通过糖抑制试验确定植物凝集素的糖结合特异性。二、设备与试剂1.设备1）96孔培养板；2）移液枪；3）普通光学显微镜；4）盖玻片；5）玻璃烧杯；6）EP管7）擦镜纸2.试剂1）样品溶液；2）兔血红细胞悬液；3）糖或糖蛋白溶液；4）生理盐水三、方法与步骤1.首先加入20ul初始浓度为1mg/ml倍比稀释的样品溶液。2.每孔加入20ul的糖（初