双分子荧光互补技术(BiFC)参考模板

1、双分子荧光互补技术（BiFC）一、技术简介BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术1. 有报道在GFP 的两个片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作

2、用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。因此，BiFC技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。本实验室成功应用该技术研究转录因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神经元中的竞争性相互作用2。BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜

3、下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音1

4、 / 3. 但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证。二、实验步骤：1. 将目的基因插入到含有N片段或C片段的载体中，构建成融合蛋白表达载体2. 转染细胞，荧光显微镜下观察是否有相互作用。三、应用实例：Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC)

5、together with ECFP. JunL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Wester

6、n blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Students t test, p<0.052.1.Hu, C.D., Y. Chinenov, and T.K. Kerppola, Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell, 2002. 9(4): p. 789-98.2.Yuan, Z., et al., Opposi