药物分析 第十四章 维生素类药物的分析

1、 维生素维持正常生理功能所必需的、维生素维持正常生理功能所必需的、微量营养微量营养物质，人体不能合成维生素。物质，人体不能合成维生素。必须从外界食物中摄必须从外界食物中摄取。取。Christiaan Eijkman1929 诺贝尔生物医学奖诺贝尔生物医学奖分类分类AB1CDE维生素维生素A的简介的简介是鱼类肝脏中提取的一种不饱和脂是鱼类肝脏中提取的一种不饱和脂肪醇，又称鱼肝油。目前主要采用肪醇，又称鱼肝油。目前主要采用人工合成。人工合成。在体内以视黄醇的形式储存，缺乏会在体内以视黄醇的形式储存，缺乏会影响视色素的合成，导致夜盲症，视影响视色素的合成，导致夜盲症，视力减退。力减退。结构结构共轭多

2、烯醇侧链的环己烯共轭多烯醇侧链的环己烯黄色棱形，黄色棱形，62-64 淡黄色棱形，淡黄色棱形，57-58无定型，无定型，28-29去氢维生素去氢维生素VitA2去水维生素去水维生素VitA3易发生脱氢、脱水、聚合反应易发生脱氢、脱水、聚合反应CH3CH2OHCH3H3CCH3CH3123456789123456789CH3H3CCH3CH3CH3CH2 溶解性溶解性: :与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水与三氯甲烷、乙醚、环已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。中不溶。 不稳定性：不稳定性：含有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被含有

3、多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。紫外光裂解，特别是在加热和金属离子存在时更易氧化变质从而失活。酸酸醛醛环环氧氧化化物物、氧氧化化剂剂紫紫外外线线、VitAVitAVitAOO2 性质性质紫外吸收：紫外吸收：共轭多烯醇侧链结构，在共轭多烯醇侧链结构，在325-328nm325-328nm之间有最大吸之间有最大吸收，可用于鉴别。收，可用于鉴别。CH3CH2ORCH3H3CCH3CH3123456789maxmax 相对生物效价相对生物效价顺反异构顺反异构维生素维生素A325.5100%全反式全反式新维生素新维生素

4、Aa32875%2顺顺新维生素新维生素Ab320.524%4顺顺新维生素新维生素Ac310.515%2，4顺顺异维生素异维生素Aa32321%6顺顺异维生素异维生素Ab32424%2，6顺顺v天然维生素天然维生素A主要是反式主要是反式紫紫红红蓝蓝色色3SbClVitACHCl3可用于鉴别和含量测定可用于鉴别和含量测定 与三氯化锑呈色与三氯化锑呈色: :三氯甲烷三氯甲烷+ +三氯化锑三氯化锑= =不稳定的蓝色不稳定的蓝色与三氯化锑呈色反应与三氯化锑呈色反应鉴别实验鉴别实验Vit ASbCl3CHCl3(无水无醇)蓝色紫红色（一）（一）Carr-Price反应反应-RCOOSbCl5+CH2蓝色蓝

5、色紫红紫红+CH2-RCOOSbCl5条件：条件： 无水、无醇无水、无醇SbCl3水水SbOCl乙醇可使碳正离子的正电荷消失乙醇可使碳正离子的正电荷消失要求仪器和试剂必须干燥无水，要求仪器和试剂必须干燥无水，三氯甲烷必须无醇三氯甲烷必须无醇VitAVitAHCl去水去水无水乙醇无水乙醇max为为326nm一个吸收峰一个吸收峰max为为350390nm三个吸收峰三个吸收峰CH3CH2ORCH3H3CCH3CH3123456789CH2五个共轭双键五个共轭双键六个共轭双键六个共轭双键最大吸收峰红移最大吸收峰红移（二）（二）UV法法维生素A在无水乙醇溶液中溶解,立即进行UV扫描,在360nm处有一最

6、大吸收峰.当盐酸水浴加热30s,迅速冷却,此过程发生脱水反应,扫描时出现三个吸收峰USP 显色剂显色剂 磷钼酸磷钼酸 规定斑点颜色和规定斑点颜色和Rf值值BP 对照品法对照品法 显色剂显色剂 三氯化锑三氯化锑（三）（三）TLC法法展开剂：展开剂： 环己烷环己烷-乙醚（乙醚（80：20）均显蓝色斑点，维生素醇（均显蓝色斑点，维生素醇（ Rf= 0.1） 维生素醋酸酯（维生素醋酸酯（ Rf= 0.45） 维生素棕榈酸酯（维生素棕榈酸酯（ Rf= 0.7） 酸值 取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示剂5滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至显粉红色，再加本品2.0g，振摇使溶解，用氢

7、氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定，酸值应不大于2.0（附录VIIH）杂质检查杂质检查过氧化值取本品1.0g，加冰醋酸-三氯甲烷（6:4）30ml，振摇使溶解，加碘化钾的饱和溶液1ml，振摇1分钟，加水100ml与淀粉指示液1ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。消耗硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）不得过1.5ml。杂质检查杂质检查含量测定含量测定（一）（一）UV法（三点校正法）法（三点校正法）维生素维生素A在在325328nm的波长范围内有最大吸收，可用紫外的波长范围内有最大吸收，可用紫外法进行含量测定但维生素法进行含量测定但维

8、生素A原料常混有杂质如：原料常混有杂质如：维生素维生素A的氧化产物的氧化产物维生素维生素A在光照下产生的无活性的聚合物在光照下产生的无活性的聚合物测定对象：测定对象：VitA醋酸酯时，醋酸酯时，ChP2015规定规定nmnmnmnm12340,316,328321211313276AAA测定对象：测定对象： VitA醇时，醇时，ChP2015规定规定nmnmnm334,310,325321求求求效价求效价)(%cm1样样 lCAcm(%)%)(1样（1）基本步骤）基本步骤换换算算因因数数）效效价价（样样样样 %)(cm1)(Eg/IU4. 测定方法测定方法A选择，选择，A328测定或测定或A3

9、28校正校正求标示百分含量求标示百分含量（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素维生素A醋酸酯的测定醋酸酯的测定）1）方法）方法 取样品适量，精密称定，加环己烷溶解取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在在300、316、328、340、360nm测吸收度，以确定最测吸收度，以确定最大吸收波长（大吸收波长（ A328或或A328校正校正）。）。b.判断法判断法 最大吸收波长在最大吸收波长在326-329nm之间，且之间，且5个波长下的绝对值个波长下的绝对值差值均不超过差值均不超过0.02时，可直接用时，可直接用328nm波长处的测得的吸波长处的测得的吸收度

10、值求得吸收系数。收度值求得吸收系数。 a.计算吸收度比值（计算吸收度比值（Ai/A328）：与中国药典的吸收度比值相）：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。最大吸收波长在最大吸收波长在326-329nm之间，计算之间，计算5个波个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，应，应按以下的方法进行判断：按以下的方法进行判断： A328校正校正=3.52（2 A328 A316-A340）（1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素维生素A醋酸酯的测定醋酸

11、酯的测定）1）方法）方法 取样品适量，精密称定，加环己烷溶解取样品适量，精密称定，加环己烷溶解在在300、316、328、340、 360nm测吸收度，测吸收度， 确定确定A2）计算）计算 a.吸光系数吸光系数E1%1cm b.求效价（求效价（IU/g）：效价指每）：效价指每g供试品所含维生素供试品所含维生素的的A的国际单位数。的国际单位数。 1IU=0.344g全反式维生素全反式维生素A醋酸酯醋酸酯换算因子1%1cmE IU/g= %),(1max/纯）效价（换算因子cmEgIU每克纯品相当多少个单位（每克纯品相当多少个单位（IU）?1IU=0.344g全反式维生素全反式维生素A醋酸酯醋酸酯

12、2907000g344. 0g101g/IU6 ）效效价价%)(1纯）效价（换算因子cmEgIU1900 醇醇维维生生素素 Ag300.0IU1 3330000g300. 0g101g/IU6 ）效效价价%)(1纯）效价（换算因子cmEgIU1830c.求维生素求维生素A占标示量的百分含量占标示量的百分含量100%L100WWDA%标示量换算因子）标示量（AA328或或A328校正校正D供试品的稀释倍数供试品的稀释倍数换算因子换算因子维生素维生素A醋酸酯在环己烷中醋酸酯在环己烷中1900； 维生素维生素A醇在异丙醇中醇在异丙醇中1830W为平

13、均内容物重量；为平均内容物重量；W为称取内容物重量（供试品取用量）为称取内容物重量（供试品取用量）L 比色池厚度比色池厚度标示量为处方中规定的每粒中所含的国际单位数标示量为处方中规定的每粒中所含的国际单位数 VitAD胶丸中胶丸中VitA的含量测定的含量测定 精密称取本品精密称取本品(规格规格10000VitAIU/丸丸)装量差异装量差异项下（平均装量项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物丸）的内容物 0.2399g 至至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取量取2.0ml，置另一，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至量瓶中，用环己烷

14、稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为，并在下列波长处测得吸收度为A300 ：0.354A316 ：0.561A328 ：0.628A340 ：0.523A360 ：0.216A300 /A328 ：0.555A316/A328 ：0.907A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.811A360/A328 ：0.299 求本品中维生素求本品中维生素A的含量？的含量？A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328

15、 ：0.833A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.010.01 0 + 0.02 + 0.04 605.0523.0561.0628.0252.3252.3340316328328AAAA校正=%)3%15(%7 .3%100328328)(328AAAf校正 %0 .99%1001000008262. 010020125022399. 01900605. 0%100)ml100/g(C1900A%328 标标示示量量平平均均丸丸重重标标示示量量校校正正适用于维生素适用于维生素A醇醇（等吸收比法） 第一法无法消除杂质干扰时用此法

16、第一法无法消除杂质干扰时用此法 皂化法、皂化法、6/7A法法 （2）第二法）第二法iKOHAnmmlIUVitAVitAS处测、于稀释至溶解异丙醇除去植物油的干扰甘油和脂肪酸盐植物油醇醋酸酯皂化液挥干乙醚乙醚提取乙醇334325310300/159/水溶性水溶性脂溶性脂溶性 判断判断 max是否在是否在323327nm之间之间取未皂化样品采用取未皂化样品采用色谱法纯化后再测色谱法纯化后再测定定 计算计算325300AA是是否否 判断判断 A300 /A325 是否大于是否大于0.73是是否否取未皂化样品采用色谱取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定法纯化后再测定 计算计算A325(校正校正) 33

17、4310325325260455528156A.A.A.A 校校正正%100AAAf325325)(325 校校正正03%3% 校正校正325A325A 校正校正325Af高效液相色谱法高效液相色谱法流动相：正己烷异丙醇（流动相：正己烷异丙醇（9973）检测波长：检测波长：325nm系统适用性实验考察分离度系统适用性实验考察分离度是否能将维生素是否能将维生素A醋酸酯顺式和反式分开醋酸酯顺式和反式分开三氯化锑比色法三氯化锑比色法蓝蓝色色 3SbClVitAmax 618nm620nm标准曲线法标准曲线法 SbOClSbClOH32缺点：缺点：呈色不稳定呈色不稳定 （5 10s内）内）水分干扰水分

18、干扰与标准曲线温差与标准曲线温差1专属性差专属性差三氯化锑有腐蚀性三氯化锑有腐蚀性优点：优点： 简便简便 快速快速维生素维生素A共轭多烯醇侧链的环乙烯共轭多烯醇侧链的环乙烯性质：脂溶性；不稳定，可与三氯化锑呈色性质：脂溶性；不稳定，可与三氯化锑呈色鉴别：三氯化锑反应；鉴别：三氯化锑反应；UV；TLC含量测定：含量测定： 紫外紫外-分光光度法（三点校正）分光光度法（三点校正） 三氯化锑比色法三氯化锑比色法AB1CDENNNH2CH2NSCH3OHH3C12345123456Cl , HCl氨基嘧啶环噻唑环亚甲基氯化氯化4-甲基甲基-3(2-甲基甲基-4-氨基氨基-5-嘧啶基嘧啶基)甲基甲基-5-

19、（2-羟基乙基）噻唑鎓盐酸盐羟基乙基）噻唑鎓盐酸盐结构与性质结构与性质维生素维生素B1（盐酸硫胺）（盐酸硫胺）第二节第二节 维生素维生素B1的分析的分析结构与性质结构与性质维生素维生素B1为白色结晶或结晶性粉末为白色结晶或结晶性粉末易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚水溶液呈酸性水溶液呈酸性1. 溶解性溶解性性质性质噻唑环、嘧啶环共轭双键噻唑环、嘧啶环共轭双键12.5g/ml盐酸溶液（盐酸溶液（9 1000）max = 246nm蓝色荧光硫色素环合开环并与嘧啶环上氨基噻唑环正丁醇铁氰化钾氧化 OH1%1cmE406 4362.硫色素荧光反应硫色素荧光反应3.UV杂原

20、子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。4.与生物碱沉淀试剂反应与生物碱沉淀试剂反应5.氯化物的特性氯化物的特性与与NaOH共热，形成硫化钠，硝酸铅生成黑共热，形成硫化钠，硝酸铅生成黑色沉淀；色沉淀；6.硫元素反应硫元素反应7.红外光谱特征红外光谱特征二、鉴别试验（一）硫色素荧光反应为维生素B1所特有NNNH2CH3CH2NSCH2CH2OHCH3Cl-HClNaOHNNNH2CH3CH2SCH2CH2OHCH3NCOHNaH2ONNCH3NNSCH2CH2OHCH3Na

21、NNCH3NNSCH2CH2OHCH3H环合NNCH3NNSCH2CH2OHCH3NaNNCH3NNSCH2CH2OHCH3O2H硫色素Thiochtome溶于丁醇，显蓝色荧光维生素维生素B1VitB1 4242HgIHBHgIK 淡黄淡黄H+白色白色硅钨酸硅钨酸 H+ OH4WO12OHSiOB23222 白色扇形白色扇形苦酮酸苦酮酸 H+沉淀反应沉淀反应 2KIIIHIB2 红色红色H+ PbSNaSVitBAcPbNaOH OHNHAgNOAgCl白白3HNO 3HNO蓝蓝淀粉试纸淀粉试纸 KIMnOClS元素反应元素反应Cl-反应反应硫元素反应和氯化物反应硫元素反应和氯化物反应H+三、

22、含量测定三、含量测定 HClOClOBHClOHClClBAcHg）（高氯酸滴定液（高氯酸滴定液（0.1mol/L）的滴定度）的滴定度(T)为为16.86mg/ml。喹那啶红亚甲蓝喹那啶红亚甲蓝(紫红紫红天蓝天蓝)NNNH2CH3CH2NSCH2CH2OHCH3Cl-HCl维生素维生素B1分子中具有共轭双键，在紫外区有吸收分子中具有共轭双键，在紫外区有吸收10.1M HCl2H203H3PO4 buffer4alcohol246232255片剂、注射剂片剂、注射剂= 421%cmE11（每片）相当于标示量的（每片）相当于标示量的%=A = ECLChP11 标示量标示量% WEA %cm 10

23、0D 100平均片重平均片重（每（每ml）相当于标示量的）相当于标示量的 标示量标示量% VEA %cm 100D 100荧荧光光硫硫色色素素异异丁丁醇醇铁铁氰氰化化钾钾 VitBNaOH硫色素荧光法：维生素硫色素荧光法：维生素B1的专属性反应的专属性反应1、2. 方法VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丁醇荧光ex-365nmem-435nm+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH + 异丁醇对照液+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH + 异丁醇供试液SdAb52 . 0dSbAml5数的供试品溶液中维生素gB13、小结小结AB1CDE维生素维生素C是胶原蛋白形成所必需

24、的，是胶原蛋白形成所必需的，有助于保持间质的完整，维生素有助于保持间质的完整，维生素C 缺乏可缺乏可导致齿龈肿胀，出血，皮下瘀点，关节及导致齿龈肿胀，出血，皮下瘀点，关节及肌肉疼痛，毛囊角化，严重缺乏可引起坏肌肉疼痛，毛囊角化，严重缺乏可引起坏血病。所以维生素血病。所以维生素C又称为抗坏血酸。又称为抗坏血酸。L-抗坏血酸(有生物活性)L-二酮古罗糖酸L-去氢抗坏血酸无生物活性结构与性质结构与性质OOHHOO COHHCH2OH123456C3OH的的pKa = 4.17C2OH的的pKa = 11.572.酸性酸性一元酸一元酸1. 溶解性溶解性易溶于水，水中呈酸性；略溶于乙醇，不溶易溶于水，水

25、中呈酸性；略溶于乙醇，不溶于三氯甲烷或乙醚于三氯甲烷或乙醚OOHHOO C OHHCH2OH123456L(+)抗坏血酸抗坏血酸活性最强活性最强比旋度比旋度+20.5+21.5手性手性C（C4、C5）3. 旋光性旋光性*含有四个光学异构体含有四个光学异构体CH2OHOOOO C OHHCH2OHCHHOCHOHCOCOCOONa HH+OH-有活性有活性有活性有活性无活性无活性OHOO C OHHCH2OHHOO4.还原性还原性二烯醇结构二烯醇结构与碱反应与碱反应单单钠钠盐盐32CONa酮酮酸酸盐盐水水解解 NaOH5. 水解反应水解反应弱碱中生成单钠盐，弱碱中生成单钠盐，强碱中水解强碱中水解

26、OHOO C OHHCH2OHHOOHOO C OHHCH2OHNaOCOONaOCOCCHOHHOCHCH2OHNa2CO3NaOH显色糠醛衍生物糠醛吡咯脱水 H糖类的显色反应糖类的显色反应蓝蓝色色糠糠醛醛吡吡咯咯脱脱水水 HVitC50结构与糖类相似结构与糖类相似6. 具糖的性质具糖的性质五碳糖五碳糖维生素维生素C7. UV特征特征维生素维生素C具有共轭双键具有共轭双键654321OOHHOO C OHHCH2OH560265243%11maxmax cmOHHEnmnm去去氢氢抗抗坏坏血血酸酸 OVitC利用还原性：与氧化剂的反应利用还原性：与氧化剂的反应鉴别试验鉴别试验OHOO C O

27、HHCH2OHHOCH2OHOOOO C OHH O（一）与（一）与AgNO3反应反应去氢抗坏血酸去氢抗坏血酸黑色黑色（二）与（二）与2，6 - 二氯靛酚反应二氯靛酚反应无无色色二二氯氯靛靛酚酚， VitC62氧化型氧化型玫瑰红色玫瑰红色（酸性）（酸性）还原型还原型蓝色蓝色(碱性碱性)NClHOClONClHOClOHH无色无色红红碱碱性性酒酒石石酸酸铜铜 OCuVitC与碱性酒石酸铜反应与碱性酒石酸铜反应与与KMnO4反应反应 MnKMnOVitC（三）与其他氧化剂反应（三）与其他氧化剂反应砖红色沉淀砖红色沉淀试剂褪色试剂褪色磷钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝与磷钼酸反应与磷钼酸反应VitC （四）薄层

28、色谱法（四）薄层色谱法（五）糖类反应（五）糖类反应OHOOHOCCH2OHHOHOHOHOOCCH2OHOHHCH2OHCHOH(CHOH)2CCOHOOH2OCH2OHCH(CHOH)2CHOOH-CO2戊糖OCHO-3H2O糠醛NOCHH2O+50蓝色NHN维生素维生素C可在三氯醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，可在三氯醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热至再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热至50 产生蓝色产生蓝色0.01mol/L HClnmmax243 58554511E%cm （五）紫外光谱法（五）紫外光谱法BP2010杂质检查杂质检查（一）溶

29、液的澄清度与颜色检查（一）溶液的澄清度与颜色检查内酯环水解内酯环水解糠醛缩合呈色糠醛缩合呈色高于或低于高于或低于pH.0-6.0空气、光线、温度空气、光线、温度维生素维生素C C脱羧脱羧控制有色杂质控制有色杂质维生素维生素C（二）铁、铜离子（二）铁、铜离子（三）草酸的检查（三）草酸的检查p草酸与金属离子作用形成沉淀；所以对草酸与金属离子作用形成沉淀；所以对Vc的原的原料，尤其是注射液，要进行草酸检查；料，尤其是注射液，要进行草酸检查；p加入加入CaCl2，比浊法；，比浊法；原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法（二）铁、铜离子（二）铁、铜离子原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法四、含量测定四、含

30、量测定维生素维生素C维生素维生素C制剂制剂碘量法碘量法二氯靛酚法二氯靛酚法紫外分光光度法紫外分光光度法高效液相色谱法高效液相色谱法指示剂指示剂 淀粉指示液淀粉指示液（一）碘量法（一）碘量法原理：利用原理：利用Vc强的还原性强的还原性OHOO C OHHCH2OHHO IHAcOO C OHHOOCH2OHHI2+ 取本品约取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷，精密称定，加新沸过的冷水水100ml与稀醋酸与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至）滴定，至溶液显蓝色，在溶液显蓝色，在30秒内不褪。每秒内不褪。

31、每1ml碘滴定液碘滴定液(0.05mol/L)相当于相当于8.806mg的的C6H8O6。2、方法、方法原料药原料药（2）酸性环境）酸性环境 稀醋酸稀醋酸 （1）新沸冷）新沸冷H2O减慢减慢VitC被被O2氧化速度氧化速度（3）立即滴定）立即滴定 赶走水中赶走水中O2，减少减少O2的干扰的干扰3、注意事项、注意事项（4）附加剂干扰的排除）附加剂干扰的排除片剂片剂 过滤过滤注射剂注射剂 抗氧剂抗氧剂 丙酮丙酮甲醛甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 （二）（二）2，6 - 二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法OHClClNHOH无 色还 原 型 酚 亚 胺Vit CH+去氢Vi

32、t C快速滴定，专属性强，用于含快速滴定，专属性强，用于含Vit CVit C的制剂与食品分析的制剂与食品分析ONOHClCl玫 瑰 红有 氧 化 性自身指示终点自身指示终点1. 原理原理空空样样二二氯氯靛靛酚酚液液空空白白样样品品VVHAcHPO 32. 方法方法（2）快速滴定）快速滴定 2min内内 （1）酸性环境）酸性环境 HPO3-HAc 稳定稳定VitC防止其他还原性物质干扰防止其他还原性物质干扰（3）亦可剩余比色测定）亦可剩余比色测定 AVitC测测二二氯氯靛靛酚酚（定量过量）（定量过量）（测剩余染料）（测剩余染料）3.注意事项注意事项（4）二氯靛酚不稳定，须临用前配制并标定）二氯

33、靛酚不稳定，须临用前配制并标定专属性强，多用于含专属性强，多用于含 Vc的制剂和食品的分析的制剂和食品的分析配制方法：配制方法：NaHCO3 42mg+水水50 ml，加二氯靛，加二氯靛酚钠二水合物酚钠二水合物0.5g +水水200 ml,过滤，即得。过滤，即得。标定方法：用干燥的维生素标定方法：用干燥的维生素C对照品进行标定对照品进行标定（三）高效液相色谱法（三）高效液相色谱法小结小结维生素维生素C（L抗坏血酸）抗坏血酸） 烯二醇结构烯二醇结构性质：水溶性；酸性；旋光性；还原性；水解性性质：水溶性；酸性；旋光性；还原性；水解性 糖类性质；紫外吸收特性糖类性质；紫外吸收特性鉴别：硝酸银反应；二

34、氯靛酚钠反应；鉴别：硝酸银反应；二氯靛酚钠反应； 氧化反应；氧化反应；TLC；糖类反应；紫外；糖类反应；紫外杂质检查：澄清度与颜色检查杂质检查：澄清度与颜色检查 铁、铜离子检查铁、铜离子检查 草酸检查草酸检查含量测定：碘量法；二氯靛酚滴定法；含量测定：碘量法；二氯靛酚滴定法； 高效液相色谱高效液相色谱 AB1CDESourcesv Sunlightv Foodsv Fortified Milkv Fish Oils Deficiencyv 佝偻病佝偻病v 牙齿松动v 鸡胸v 骨质疏松v 脚成弓形 Function v促进钙、磷的吸收；v促进骨骼和牙齿的正常生长；v调节柠檬酸的代谢第四节第四节

35、维生素维生素D D的分析的分析HO-2HHOBUVHOHOBUVHO胆甾醇7-脱氢胆甾醇维生素 D3 (胆骨化醇) 维生素 D2(麦角骨化醇)麦角甾醇 维生素维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称，目前有是一类抗佝偻病维生素的总称，目前有10多种，都是甾醇衍生物。多种，都是甾醇衍生物。HOHCH2H H HHHHCH3CH3CH3CH3CH3HOHCH2H H HHHCH3CH3CH3CH3 维生素维生素D2 维生素维生素D3维生素维生素D2、D3无色针状结晶或白色结晶性粉末；无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。无臭，无味；遇光或空气均易变质。 溶解性溶解性:维生素维生素

36、D2在三氯甲烷中极易溶解在三氯甲烷中极易溶解,在丙酮乙醇乙醚在丙酮乙醇乙醚中易溶；维生素中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。不稳定性不稳定性:毒性增强毒性增强.含有多个烯键，所以极不稳定，宜氧含有多个烯键，所以极不稳定，宜氧化变质，效价降低，毒性增强。化变质，效价降低，毒性增强。旋光性旋光性:有五到六个手性碳原子有五到六个手性碳原子,均具有旋光性均具有旋光性. 维生素维生素D2 6个手性碳原子个手性碳原子 维生素维生素D3 5个手性碳原子个手性碳原子 HOHCH2H H

37、 HHHHCH3CH3CH3CH3CH3HOHCH2H H HHHCH3CH3CH3CH3显色反应显色反应 甾类化合物甾类化合物氯仿溶液氯仿溶液 黄色黄色 红色红色 紫色紫色 绿色绿色紫外吸收特性紫外吸收特性 无水乙醇无水乙醇 265nm 265nm 维生素维生素D D2 2 为为460460490490 维生素维生素D D3 3 为为465465495495醋酐醋酐硫酸硫酸E1cm1%E1%1cm二、鉴别试验二、鉴别试验 （一）显色反应（一）显色反应1 1与醋酐与醋酐- -浓硫酸反应浓硫酸反应 氯仿溶液氯仿溶液 黄色黄色 红色红色 紫色紫色 绿色绿色醋酐醋酐硫酸硫酸2 2与三氯化锑反应与三氯

38、化锑反应 本品本品1,2-1,2-二氯乙烷二氯乙烷 三氯化锑试液三氯化锑试液 橙红色橙红色 粉红色粉红色 3 3其它显色反应其它显色反应 维生素维生素D D 三氯化铁三氯化铁 橙黄色橙黄色 二氯丙醇二氯丙醇 乙酰氯乙酰氯 绿色绿色 （二）比旋度鉴别（二）比旋度鉴别无水乙醇溶液无水乙醇溶液 维生素维生素D D2 2 比旋度为比旋度为102.5102.5至至107.5107.5 维生素维生素D D3 3 比旋度为比旋度为105105至至112112 （三）其它鉴别方法三）其它鉴别方法 薄层色谱法、薄层色谱法、HPLCHPLC法法制备衍生物测熔点制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱紫外、红外吸收光谱

39、 （四）维生素（四）维生素D D2 2、D D3 3的区别反应的区别反应维生素维生素D D2 2 维生素维生素D D3 3 96%96%乙醇乙醇 10ml 取取0.1ml0.1ml 乙醇乙醇1ml1ml和和85%85%硫酸硫酸5ml5ml 红色红色max570nm 黄色黄色 max495nm 三、杂质检查三、杂质检查（一）麦角甾醇的检查（一）麦角甾醇的检查维生素维生素D D2 290% %乙醇溶液乙醇溶液 洋地黄皂苷溶液洋地黄皂苷溶液 不得发生浑浊或沉淀不得发生浑浊或沉淀 （二）前维生素（二）前维生素D D的光照产物的光照产物（三）有关物质检查（三）有关物质检查Ch.P 2010NP-HPLC

40、含量测定USP34-NF29化学法色谱法微生物法BP2010化学法色谱法光谱法四、含量测定四、含量测定正相高效液相色谱法正相高效液相色谱法 （一）维生素（一）维生素D D测定法测定法 含量以单位表示含量以单位表示每单位相当于维生素每单位相当于维生素D 0.025D 0.025g g 注意：计算的是维生素注意：计算的是维生素D D及前维生素及前维生素D D经折经折 算成维生素算成维生素D D的总量的总量u 固定相：硅胶u 流动相：正己烷正戊醇（997：3）u 检测波长：254nm第一法：用于无维生素A醇及其他干扰的供试品第二法：(1)皂化提取 ;(2)净化用色谱柱系统分离收集维生素D，得供试品溶

41、液B;(3)按第一法进行测定。第三法：当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受干扰时，采用此法。小结小结维生素维生素D抗佝偻病维生素的总称抗佝偻病维生素的总称性质：脂溶性；不稳定；旋光性；性质：脂溶性；不稳定；旋光性； 显色反应；紫外显色反应；紫外鉴别：显色反应；比旋度；鉴别：显色反应；比旋度； VD2、VD3区别区别杂质检查：麦角甾醇；杂质检查：麦角甾醇； 前维生素前维生素D光照产物；有关物质光照产物；有关物质含量测定：含量测定： 三法三法AB1CDE主要讲解第五节第五节 维生素维生素E的分析的分析维生素维生素E E早在早在2020世纪世纪2020年代就被人们年代就被人们

42、发现，发现，EvansEvans和他的同事在研究生殖和他的同事在研究生殖过程中发现，酸败的猪油可以引起大过程中发现，酸败的猪油可以引起大鼠的不孕症。鼠的不孕症。是与生育有关的维生素的总称是与生育有关的维生素的总称1936 1936 年分离出结晶体年分离出结晶体1938 1938 年被瑞士化学家人工合成年被瑞士化学家人工合成维生素维生素E的显微照片的显微照片维维生生素素E胶胶囊囊名称R1R2烃链相对活性-生育酚CH3CH3C16H331.0-生育酚CH3HC16H330.5-生育酚HCH3C16H330.2-生育酚HHC16H330.1-生育酚CH3HC16H270.5 2R*(4R*,8R*)

43、-3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-2H-苯并吡喃苯并吡喃-6-醇醋酸酯 -生育酚醋酸酯生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10（天然品）（天然品）（合成品）（合成品）l 性状性状:黄色或金黄色黄色或金黄色粘稠状粘稠状透明透明液体液体l 脂溶性脂溶性:溶于溶于丙酮、乙醇、乙醚或植物油丙酮、乙醇、乙醚或植物油等等有机溶剂有机溶剂中中l 水溶性水溶性:不不溶于水溶于水l 稳定性稳定性:无氧时对热、酸稳定，对碱不稳定，无氧时对热、酸稳定，对碱不稳定， 对氧敏感，遇光可被氧化，对氧敏感，遇光可被氧化，色渐变深，色渐变深， OorOHHVitE醌醌型型化

44、化合合物物生生育育酚酚l UV：乙醇溶液中：乙醇溶液中max284nm（一）（一） 硝酸反应硝酸反应二、鉴别试验二、鉴别试验CH3HOOCH3C16H33CH3H3C生育酚HNO3OOCH3C16H33H3CCH3O（橙红色）生育红维生素维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚OCH3CH3CH3CH3CH3-COOC16H33HOOCH3CH3CH3CH3C16H33水解水解三氯化铁联吡啶反应三氯化铁联吡啶反应红红色色生生育育醌醌对对生生育育酚酚联联吡吡啶啶 2FeKOHFeVitE3O（二）（二）OOH3CCH3OHCH3C16H33CH3CH3HOOCH3

45、C16H33CH3H3C生育酚生育酚对对-生育醌生育醌+23F e3+2F eNNNN红色红色Fe3+Omax = 284nmmin = 254nm0.01%无水乙醇中无水乙醇中UV法法（三）（三）薄层板薄层板 硅胶硅胶G展开剂展开剂 环己烷环己烷 -乙醚（乙醚（4 ：1）显色剂显色剂 硫酸（硫酸（105 5） TLC法法（四）（四）VitE Rf = 0.7 -生育酚生育酚 Rf = 0.5 -生育醌生育醌 Rf = 0.92,3,5-三甲基对二苯酚植醇+-生育酚-生育酚醋酸酯 三、杂质检查三、杂质检查 三、杂质检查三、杂质检查 （一）酸度（一）酸度游离醋酸游离醋酸（二）生育酚 硫酸铈滴定液

46、（硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄二苯胺（亮黄灰紫）灰紫）生生育育醌醌对对生生育育酚酚 3422CeCe 利用游离生育酚的还原性，利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈将硫酸铈还原成硫酸亚铈 三、杂质检查三、杂质检查 1.原理原理2.试剂试剂 计算每ml硫酸铈滴定液（0.01mol/L）相当于0.002154g的游离生育酚%100WTV% 限量限量2.15%15. 2%1001 . 0002154. 00 . 1% 限限量量限量限量 (三)有关物质的检查 (四)残留溶剂：环己烷的检查四、含量测定四、含量测定GC法法（一）（一）1、选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高速度快速度

47、快分离效能好分离效能好挥发性低、不稳定、挥发性低、不稳定、极性强极性强衍生化。衍生化。易受样品蒸气压限易受样品蒸气压限制制载气载气N2固定液固定液硅酮（硅酮（OV-17）担体担体硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱温柱温265检测器检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标内标正三十二烷正三十二烷 n 500 R2内标法加校正因子定量内标法加校正因子定量2、VitE测定的色谱条件测定的色谱条件内标法内标法供试液（样品供试液（样品+内标）内标）内标物内标物对照液（对照对照液（对照+内标）内标）是样品中不存在的物质是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近与被测组分峰靠近能与各组分完全分离能与各组分完全分离与被测组分的量接近与被测组分的量接近样品样品 dl生育酚生育酚固定相固定相十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶流动相流动相甲醇甲醇-水（水（49 ：1）检测波长检测波长292nm R2.6 RSD0.8%（二）（二）HPLC法（外标法）法（外标法）（三）荧光分光光度法对照品对照品 dl生育酚生育酚在在220400nm波长范围内，以发射、激发波长范围内，以发射、激发波长间隔波长间隔为为40nm40nm扫描同步荧光光谱，扫描同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。测定同步荧光峰的荧光强度信号值。 VE=F样品样品-F空白空白F标准标准-