黄酮类化合物的结构.总结

1、一、利用紫外光谱测定黄酮类化合物的结构大多数黄酮类化合物在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在 300400nm之间的吸收带称为带，出现在 240280nm之间的吸收带称为带。不同类型的黄酮化合物的带或带的峰位、 峰形和吸收强度不同，因此从紫外光谱可以推测黄酮类化合物的结构类型。当向黄酮类化合物的甲醇（或乙醇）溶液中分别加入甲醇钠（ NaOMe）、乙酸钠（ NaOAc）、乙酸钠 - 硼酸（ NaOAc-H3BO3）、三氯化铝或三氯化铝 - 盐酸（ AlCl3/HCl ）试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等， 导致光谱发生变化。据此变化可以判断各类化合物的结构，这些试剂对结构具有诊

2、断意义，称为诊断试剂。黄酮和黄酮醇类（一）黄酮、黄酮醇类在甲醇中的 UV光谱特征黄酮或黄酮醇的带是由 B 环桂皮酰基系统的电子跃迁所引起的吸收，带是由 A 环的苯甲酰基系统的电子跃迁所引起的吸收。黄酮和黄酮醇的 UV 光谱图形相似，仅带位置不同，黄酮带位于 304350nm，黄酮醇带位于 358385nm。利用带的峰位不同，可以区别这两类化合物。黄酮、黄酮醇的 B 环或 A 环上取代基的性质和位置不同将影响带或带的峰位和形状。例如， 7 和 4位引入羟基、甲氧基等含氧取代基，可引起相应吸收带向红位移。 又如 3- 或 5- 位引入羟基， 因能与 C4O形成氢键缔合， 前者使带向红位移，后者使带

3、、带均向红位移。 B 环上的含氧取代基逐渐增加时，带向红位移值（ nm）也逐渐增加，但不能使带产生位移。有时（例如 3， 4 - 位有 2 个羟基或 2 个甲氧基或亚甲二氧基）仅可能影响带的形状，使带歧分为双峰或 1 个主峰（ b 位于短波处）和 1 个肩峰（ sh）或弯曲（ a 位于长波处）。A 环上的含氧取代基增加时，使带向红位移，而对带无影响，或影响甚微（但 5- 羟基例外）。黄酮或黄酮醇的 3- ，5- 或 4- 羟基被甲基化或苷化后，可使带向紫位移，3-OH甲基化或苷化使带（ 328 357nm）与黄酮的带的波长范围重叠（且光谱曲线的形状也相似） ，5-OH 甲基化使带和带都向紫位移

4、5 15nm，4 -OH 甲基化或苷化，使带向紫位移 310nm。其他位置上的羟基取代对甲醇中的紫外光谱几乎没有影响。（二）利用诊断试剂对黄酮、黄酮醇类化合物UV光谱的影响检出羟基位置1甲醇钠（ NaOMe），主要是判断是否有4-OH， 3、4二 OH或 3、3、4三 OH。2乙酸钠，较为突出的是判断是否有7-OH。举例说明3乙酸钠/ 硼酸主要判断A 环或B 环是否有邻二酚羟基（5，6- 二OH除外）。举例说明4三氯化铝及三氯化铝/ 盐酸，为判断有无邻二酚羟基，3-OH、5-OH提供信息。（三）异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类在甲醇中的UV光谱特征这三类化合物都有苯甲酰系统，而无桂皮酰结构，所以

5、它们的紫外光谱都有强的带吸收，异黄酮带吸收在245270nm，而二氢黄酮和二氢黄酮醇的带在 270 295nm，一般只受 A 环的含氧取代基的影响，A 环含氧取代基数增加，吸收峰向红位移。（四）利用诊断试剂对异黄酮、 二氢黄酮和二氢黄酮醇类化合物的 UV光谱的影响判断羟基位置1甲醇钠带向红位移，示A 环上有羟基。如有 5，6，7- 或 5，7，8- 三羟基或 3， 4 - 二羟基，则吸收带将随放置的延长而逐渐衰退。二氢黄酮、 二氢黄酮醇带向红位移的大小取决于是否有游离的5-OH。2乙醇钠乙醇钠使 7- 羟基异黄酮的带向红位移 620nm，但 6- 位有含氧取代基时，乙醇钠几乎不能使带产生移动。

6、 4，5，6，7- 四羟基异黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。乙醇钠使 5，7- 二羟基二氢黄酮和5，7- 二羟基二氢黄酮醇带向红位移 34 37nm，而其相应的 5- 去氧化合物则移动 51 58nm。5，6，7- 三羟基二氢黄酮的紫外光谱随时间延长而衰退。3乙醇钠 / 硼酸不能用 NaOAc/H3BO3对异黄酮、二氢黄酮和二氢黄酮醇类的紫外光谱的影响来检查 B环邻位二羟基，因为它们的 B环与主要发色团缺少有效的共轭。但它们中的 A 环有 6，7- 二羟基时，加入 NaOAc/H3BO3后使带向红位移 1015nm。4三氯化铝和三氯化铝 / 盐酸异黄酮、二氢黄酮（可能也包括二氢黄酮醇） 的 A

7、 环如有邻二羟基（ 6， 7- 或 7，8- ，不包括 5，6- ），则带在 AlCl3 中比在 AlCl3/HCl 中向红位移1130nm。有 5- 羟基的异黄酮， 其带在 AlCl3/HCl 存在下与在甲醇中的光谱相比，向红位移 1014nm，而有 5- 羟基的二氢黄酮和有 5- 羟基的二氢黄酮醇类的带在同样情况下向红位移 20 26nm。目标检测：黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于谱学的综合解析，而化学方法和色谱方法已降至辅助地位。未知黄酮类化合物的鉴定，多在测定分子式的基础上，利用 PPC或 TLC得到的 Rf 值或 hRf 值与文献比较或分析对比样品在甲醇溶液中及加入各种诊断试

8、剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析。同时，对于化合物的颜色反应，以及在提取分离过程中所表现的行为（如溶解度、酸或碱中的溶解情况、铅盐沉淀等）也应注意分析。但这些方法均有一定局限性，并曾导致得出过一些错误结论。质子核磁共振（ 1HNMR）因为可定量测定 H 的个数，以及根据质子的化学位移和芳香氢核之间的自旋偶合所提供的信息（裂分数目及偶合常数大小） ，可确定黄酮母核上的取代模式。 近来由于仪器分辨率的不断改进，加以同核去偶、溶剂位移以及核磁共振技术的使用， 1H NMR谱的测定对分析天然黄酮类化合物的结构已经成为一种非常重要的手段。 但是正如以后谈到的那样， 在黄酮类化合物的 1H-NMR谱上，有

9、时要想确切指认每个信号并不是一件容易的事情。 例如当黄酮类母核的 A-环上只有一个芳香氢核时，要想与 H-3 信号区别，就是十分困难的问题。解决这种问题， 13C 核磁共振 (13CNMR)技术有很大的优势。加上各种取代基位移及苷化位移效应的发现，使得图谱的解析工作大大简化。因此， 13C-NMR技术在黄酮类化合物的结构鉴定中发挥着越来越重要的作用。 质谱（MS）技术，尤其场解析质谱（ FDMS）与快速原子轰击质谱（ FABMS）及串联质谱（ MS MS）的出现与应用，使其成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段之一（质谱技术的优势是只需要微量的样品就可获得有关整个分子结构及其主要碎片结构的重要信息

10、）。实际工作中常常根据需要，灵活、综合运用上述方法和手段，并辅以必要的化学方法，以求结构鉴定获得满意的结果。二、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用纸色谱（PPC）适用于分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物。 混合物的鉴定常采用双向色谱法。以黄酮苷类来说，一般第一向展开采用某种醇性溶剂，如 n-BuOH HOAcH2O（415 上层，BAW）、t-BuOHHOACH2O（ 3 11，TBA）或水饱和的 n-BuOH等，这些主要是根据分配作用原理进行分离。第二向展开溶剂则用水或下列水溶液， 如：2 6HOAc、3NaCl 及 HOAc-浓 HClH2O（30310）等。它们主要是根据吸附作用原理

11、进行分离。黄酮类化合物苷元一般宜用醇性溶剂或用C6H6 HOAcH2O（ 12572 3）、CHCl3 HOAC H2O（ 136l ）、PhOH-H2O（41）或 HOAC一浓 HCl-H2O（3033） 进行分离。而花色苷及花色苷苷元，则可用含 HCl 或 HOAC的溶液作为展开剂。多数黄酮类化合物在纸色谱上用紫外光灯检查时，可以看到有色斑点，以氨蒸气处理后常产生明显的颜色变化。此外还可喷以 2 AlCl3 （甲醇）溶液（在紫外光灯下检查） 或 1FeC131K3Fe(CN)6（ 1 1）水溶液等显色剂。黄酮类化合物苷元中，平面性分子如黄酮、黄酮醇、查耳酮等，用含水类溶剂如 3 5HOAC

12、展开时，几乎停留在原点不动（Rf0.02 ；而非平面性分子如二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢查耳酮等，因亲水性较强，故Rf 值较大 (0.10 0.30) 。黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中 Rf 值相应降低，同一类型苷元， Rf 值依次为：苷元单糖苷双糖苷。以在 BAW中展开为例，多数类型苷元（花色苷元例外） Rf 值在 0.70 以上，而苷则小于 0.70 。但在用水或 2 8 HOAC，3 NaCl 或 1 HCl 展开时，则上列顺序将会颠倒， 苷元几乎停留在原点不动， 苷类的 Rf 值可在 0.5 以上，糖链越长，则 Rf 值越大。另外，糖的结合位置对 Rf 值

13、也有重要的影响。不同类型黄酮类化合物在双向 PPC展开时常常出现在特定的区域，因此可推测它们的结构类型以及判定是否成苷以及含糖数量。 除 PPC外，TLC用于黄酮类化合物的鉴定也日趋广泛。一般采用吸附薄层色谱，常用的吸附剂有硅胶与聚酸胺，其次是纤维素。硅胶薄层色谱；用于分离与鉴定弱极性黄酮类化合物较好。分离黄酮苷元常用的展开剂是甲苯 - 甲酸甲酯 - 甲酸 （ 5 4 1），并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。另外尚有苯 - 甲醇 (95 ： 5) 、苯 - 甲醇 - 醋酸（ 35 5 5）、氯仿一甲醇（ 8.5 1.5 70.5 ）、甲苯 - 氯仿 - 丙酮 (4O 2

14、535) 、丁醇一吡啶 - 甲酸 (40 10： ) 等分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或醋酸乙酯等中性成分，可用苯 - 丙酮（ 9 1）、苯 - 醋酸乙酯 (7.5 2.5 ）等为展开剂。聚酸胺薄层色谱：适用范围较广，特别适合于分离合游离酚羟基的黄酮及其苷类。由于聚酸胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要可以破坏其氢键缔合的溶剂为展开剂。在大多数展开剂中含有醇、酸或水。常用的展开剂有乙醇一水(3 2) 、水 -乙醇 - 乙酸丙酮 (4 21) 、水- 乙醇 - 甲酸 - 乙酸丙酮 (5 1.5 l ：0.5) 、水饱和的正丁醇一醋酸（ 100 1 100 2）、丙酮 - 水（ 1 1）、丙酮 -9

15、5 乙醇 - 水（ 2 1 2）、95乙醇 - 醋酸（ 1002）、苯 - 甲醇 - 丁酮（6020 20）等。 Stahl 总结前人的工作，介绍了一些黄酮苷元和黄酮苷用硅胶、聚酸胺与纤维素三种薄层色谱和四种混合溶剂作为展开剂所得到的hRf 值。三、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用紫外及可见分光光度法是鉴别黄酮类化合物结构的一种重要手段，一般程序如下：（ 1）测定样品在甲醇溶液中的 UV光谱；（ 2） 测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的 UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠（ NaOMe）醋酸钠（ NaOAc）、醋酸钠一硼酸（ NaOAc H3BO3）三氯化铝（ AICI3

16、 ）及三氯化铝一盐酸（ AICI3 HCI）等。提取与分离一、提取黄酮类化合物在花、叶、果等组织中，一般多以苷的形式存在，而在木部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等） ，一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。其中用得最多的是甲醇水（ 11）或甲醇。一些多糖苷类则可以用沸水提取。在提取花青素类化合物时， 可加入少量酸（如 0.1 盐酸）。但提取一般黄酮苷类成分时，则应当慎用， 以免发生水解反应。 为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解， 常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性。大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂

17、，如氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取，对多甲氧基黄酮的游离苷元， 可用苯进行提取。对得到的粗提取物可进行精制处理，常用的方法有：（一）溶剂萃取法： 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同， 选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化目的。 例如植物叶子的醇浸液， 可用石油醚处理， 以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素。 而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质。有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行。 常用的溶剂系统有： 水一醋酸乙酯，正丁醇一石油醚等。溶剂萃取过程在除去杂质的同时， 往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。（二）碱提取酸沉淀法黄

18、酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将碱水提取液调成酸性， 黄酮苷类即可沉淀析出。 此法简便易行，如芦丁、橙皮苷、黄芩苷提取都应用了这个方法。 现以从槐米中提取芦丁为例说明该法的操作过程。槐米（槐树 SOphora japonica L 花蕾）加约 6 倍量水，煮沸，在搅拌下缓缓加入石灰乳至 pH 8 9，在此 pH 条件下微沸 20 30 min ，趁热抽滤，残渣再加 4 倍量的水煎一次，趁热抽滤。合并滤液，在 6070t 的条件下，用浓盐酸将合并滤液调至 PH为 5，搅匀后静置 24 h，抽滤。用水将沉淀物洗至中性， 60 干燥得芦丁粗品，用沸

19、水重结晶， 70 一 80干燥后得芦丁纯品。在用碱酸法进行提取纯化时， 应当注意所用碱液浓度不宜过离， 以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成样盐，致使析出的黄酮类化合物又重新溶解， 降低产品收率。 当药材中含有大量果胶、 粘液等水溶性杂质时， 如花、果类药材，宜用石灰乳或石灰水代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐沉淀， 不被溶出。这将有利于黄酮类化合物的纯化处理。（三）炭粉吸附法主要适于苷类的精制工作。通常，在植物的甲醇粗提取物中，分次加入活性炭，搅拌，静置，直至定性检查上清液无黄酮反应时为止。 过滤，收集吸附苷的炭末，依次用沸水、

20、佛甲醇、 7酚一水、 15酚一醇溶液进行洗脱。对各部分洗脱液进行定性检查（或用 PPC鉴定）。通过对 BaPtisia lecontei 中黄酮类化合物的研究证明，大部分黄酮耷类可用 7酚一水洗下。洗脱液经减压蒸发浓缩至小体积，再用乙酸振摇除去残留的酚，余下水层减压浓缩即得较纯的黄酮苷类成分。二、分离现将较常用的分离方法介绍如下：（一）柱色谱法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、 聚酰胺及纤维素粉等。 此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土等。1硅胶柱色谱此法应用范围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及离度甲基化（或乙醇化）的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离

21、极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。 供试硅胶中混存的微量金属离子，应预先用浓盐酸处理除去，以免干扰分离效果。2聚酰胺柱色谱 对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。 聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮类化合物， 包括苷及苷元、 查耳酮与二氢黄酮等。 以 Baptisialecontei 为例：黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时大体有下述规律：（ 1）苷元相同，洗脱先后顺序一般是：叁糖苷、双糖苷、单糖苷、苷元。（ 2）母核上增加羟基，洗脱速度即相应减慢。当分子中羟基数

22、目相同时，羟基位置对吸附也有影响， 聚酰胺对处于羰基间位或对位的羟基吸附力大于邻位羟基，故洗脱顺序为：具有邻位羟基黄酮，具有对位（或间位）羟基黄酮。（ 3）不同类型黄酮化合物， 先后流出顺序一般是： 异黄酮、二氢黄酮醇、黄酮、黄酮醇。（ 4）分子中芳香核、共轭双键多者易被吸附，故查耳酮往往比相应的二氢黄酮难于洗脱。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱上的行为。3葡聚糖凝胶（ Sephadex gel ）柱色谱对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶： SephadexG型及 SephadexLH厂型。 用葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制是：分离游离黄酮时， 主要靠吸附作用。 凝胶对

23、黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚羟基的数目。但分离黄酮苷时，则分子筛的性质起主导作用。在洗脱时，黄酮苷类大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体。表 6-5 中 Ve 为洗脱样品时需要的溶剂总量或洗脱体积； V0 为柱子的空体积。VeV0 数值越小说明化合物越容易被洗脱下来。上表所列数据清楚地表明：苷元的羟基数越多， VeV0 越大，越难以洗脱，而苷的分子量越大，其上联结糖的数目越多，则 VeV0 越小，越容易洗脱。葡聚糖凝胶柱色谱中常用的洗脱剂有：（ 1）碱性水溶液（如 0 1mol L NH4OH），含盐水溶液（05 molL NaCI 等）。（ 2）醇及含水醇，如甲醇，甲醇水（不同比例）

24、 ，叔丁醇甲醇（ 3： 1）、乙醇等。（ 3）其他溶剂，如含水丙酮、甲醇氯仿等。（二）铅盐法此法过去曾用于研究， 目前已很少采用。 一般是在乙醇或甲醇溶液中依次加入适量中性醋酸铅、碱式醋酸铅水液，分别使具有邻二酚羟基成分（包括黄酮）及含羟基成分，具有一般酚羟基的成分分离， 再分别将铅盐沉淀悬浮于醇中， 脱铅后得到成分。（三）硼酸铬合法有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合， 生成物易溶于水， 借此可与无邻二酚羟基的黄酮类化合物相互分离。（四） pH梯度萃取法pH 梯度萃取法适合于酸性强弱不同的游离的黄酮类化合物的分离，将混合物溶于有机溶剂（如乙醚）中，依次用 5NaHCO3（萃取出 7，4二羟

25、基黄酮） 、5Na2CO3（萃取出 7或 4羟基黄酮）、0.2 NaOH（萃取出具一般酚羟基黄酮） 、4NaOH（萃取出 5羟基黄酮）萃取而使之分离。聚酰胺薄膜的分离机制主要是分子键氢键和吸附。当展开剂为不同比例的醇- 水时，其分离机制与反相板类似， 苷元较苷的 Rf 值低；当展开剂为有机溶剂时，分离机制与正相板类似，苷元较苷的 Rf 值高。常用显色剂多了去了，看你是要用于鉴别什么了。碘蒸气是通用显色剂， 对很多化合物都显黄棕色。 碘显色过程中由碘蒸气分子与化合物发生结合而显色。香草醛浓硫酸显色原理是使羧基脱水， 增加双键结构， 再经双键位移， 双分子缩合等反应生成共轭双键系统，又在酸作用下形

26、成阳碳离子盐而显色。比如：（1）矾酸铵一浓硫酸溶液（Mandelin 试剂）为 1矾酸铵的浓硫酸溶液。如遇阿托品显红色，可待因显蓝色，士的宁显紫色到红色。（ 2）钼酸铵一浓硫酸溶液 （Frohde 试剂）为 1钼酸钠或钼酸铵的浓硫酸溶液，如遇乌头碱显黄棕色，小檗碱显棕绿色，阿托品不显色。（ 3）甲醛一浓硫酸试剂 （Marquis 试剂）为 30甲醛溶液 0.2ml 与 10ml 浓硫酸的混合溶液。如遇吗啡显橙色至紫色，可待因显红色至黄棕色。（ 4）浓硫酸 如遇乌头碱显紫色、小檗碱显绿色，阿托品不显色。（ 5）浓硝酸 如遇小檗碱显棕红色，秋水仙碱显蓝色，咖啡碱不显色。(1) 重络酸钾 - 硫酸

27、: 检查一般有机物 .喷洒剂 :5 克重络酸钾溶于100 毫升 40%硫酸中 .薄层检查 : 喷洒后加热到 150至班点出现(2) 荧光素 - 溴: 检查不饱和化合物喷洒剂 :0.1 克荧光素溶于 100 毫升乙醇中溴试剂 :5%的溴的四氯化碳溶液喷洒后处理 : 喷洒荧光素溶液后 , 放置存有溴溶液的缸内 , 可于紫外线分析灯下检查荧光 , 荧光素与溴化和成曙红 (Eosin)( 无萤光 ), 而不饱和化合物则成溴加成物 , 保留了原有荧光 ; 若点样较多 , 则呈黄色斑点 , 底板呈红色 .(3) 碘: 检查一般有机物 .方法 :a 层析谱放密闭缸内或瓷盘内，缸内预先放有碘结晶少许，大部分有

28、机化合物呈棕色斑点。B 层析谱放碘蒸气中 5 分钟（或喷 5碘的氯仿溶液）取出置空气中待过量的碘蒸气全部挥发后，喷 1淀粉的水溶液，斑点转成蓝色。（ 4）硫酸：通用喷洒剂：5的浓硫酸乙醇溶液， 或 15浓硫酸正丁醇溶液， 或浓硫酸醋酸（ 1：1）喷洒后处理：空气中干燥15 分钟，再热至 110直至出现颜色或荧光。（ 5）硝酸银氢氧化铵（ Tollen-Zaffaroni ）试剂：检查还原性物质。溶液 I : 0.1%N 硝酸银 ; 溶液 II: 5N 氢氧化铵喷洒剂 : I 和 II 以 1:5 混合( 临用前混合 )喷洒后处理 : 105 加热 510 分钟 , 至深黑色斑点出现 .(6)

29、磷钼酸或磷钨酸 , 硅钨酸 : 检查还原性物质 , 类脂体 , 生物碱 , 甾体喷洒剂 : 510%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液喷洒后处理 : 120 加热至斑点出现 .沉淀试剂 : 1 克硅钨酸溶于 20 毫升水中 , 加 10%盐酸至强碱性 .生物碱(7) 硫酸 ?=硫酸 : 检查生物碱及含碘化合物喷洒剂 : 0.1 克硫酸 ?混悬于 4 毫升水中 , 加入 1 克三氯醋酸 , 加热至沸 , 逐滴加入浓硫酸至澄清 .喷洒后处理 : 110 加热数分钟至斑点出现.(8) 碘化铋钾 (Dragendorff) 试剂 : 检查生物碱及其他含氟化合物 . 溶液 I: 0.85 克次硝酸铋溶于 1

30、0 毫升冰醋酸 40 毫升水中溶剂 II: 8 克碘化钾溶于 20 毫升水中 .制备液 I+II, 等体积混合 . 可用于棕色瓶中保存较长时间 , 一般制备液可作沉淀试剂用 .喷洒液 : 制备液 1 毫升与 2 毫升醋酸 ,10 毫升水混合即得(9). 碘化汞钾 (Mayer) 试剂 : 检查生物碱 .制备液 : 13.55 克氯化汞和 49.8 克碘化钾各溶于 20 毫升水中 , 等体积混合并用水稀释至 1000 毫升 .喷洒液 : 制备液加 1/10 体积的 17%盐酸 .喷洒后处理 : 观察斑点 , 并于紫外线荧光分析灯下检出 .(10) ? 酸纳 - 浓硫酸 (Mandelin) 试剂

31、 : 检查生物碱 . 1%酸纳的浓硫酸溶液 . 与多种生物碱呈不同颜色 .(11) 碘碘化钾 (Wagner) 试剂 : 检查生物碱 .1 克碘及 10 克碘化钾 , 溶于 50 毫升水中 , 加热 , 加 2 毫升醋酸 , 再用水稀释至 100 毫升 .可作纸层板显色剂 , 液可作沉淀试剂 .酚类, 鞣质(12) 三氯化铁 : 检查酚类及 ?酸.喷洒剂 :15%三氯化铁的水溶液或乙醇溶液 . 并加盐酸少许 .? 酸呈红色斑点 , 酚类称蓝色或绿色斑点 .(13) 铁氰化钾 - 三氯化钾 : 检查酚类 , 芳香胺类及还原性物质 .喷洒剂 : 1% 铁氰化钾水溶液 ,2%三氯化铁水溶液 . 临用

32、前等体积混合 .喷洒后处理 : 喷洒后酚性物质呈蓝色斑点 . 再喷 2N 盐酸 , 能使颜色加深 , 纸谱可用烯盐酸洗去喷洒液 .(14) 4- 胺基安替比林 - 铁氰化钾 (Emerson 反应 ): 检查酚类 .喷洒剂 : I . 2%4-氨基安替比林乙醇溶液 ;II. 8% 铁氰化钾水溶液 .或用 0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液方法 : 先喷洒 I, 再喷洒 II, 即显色 , 或再放入密闭缸中 , 缸内放 25%氢氧化铵 , 即产生橙色至深红色 .(15) 对氨基苯磺酸 , 重氮盐 (Pauly 试剂 ): 检查酚类 , 芳香胺类及能偶合的杂环化合物 .喷洒剂 : 4

33、.5 克对氨基苯磺酸 , 加热溶于 45 毫升 12N 盐酸中 , 用水稀释至 500 毫升 , 取 10 毫升稀释液用冰冷却 , 加 10 毫升冷 4.5%亚硝酸钠水溶液 ,0 放 15 分钟( 此试剂于 0可保存 3 天), 用前加等体积1%碳酸钠水溶液 .一般重氮化试剂 , 也可用联苯胺 , 对硝基苯胺等 .(16) 对甲苯磺酸 : 检查甾体 , 黄酮 , 鞣质 . 喷洒剂 : 20% 对甲苯磺酸氯仿溶液 .喷洒后处理 : 100 加热数分钟 , 紫外线分析灯下检查荧光斑点 .含氧杂环及蒽醌类 *(17) 三氯化铝 : 检查黄酮体 .喷洒 1%三氯化铝乙醇液于紫外线荧光分析灯下检示, 呈

34、黄色荧光(18) 碱式醋酸铅 : 检查黄酮体 .喷洒剂 :饱和碱式醋酸铅 ( 或饱和醋酸铅 ) 水溶液 .于紫外线荧光分析灯下检查荧光斑点.(19) 醋酸镁 : 检查蒽醌甙 , 甙元及黄酮体喷洒剂 : 0.5% 醋酸镁甲醇溶液方法 : 90 加热 5 分钟 , 呈红色至紫色斑点 .(20) 氢氧化钾 : 检查香豆素 , 蒽醌甙及甙元喷洒剂 : 510%氢氧化钾的甲醇溶液 .于日光及紫外线荧光分析灯下检示斑点 .萜类, 甾体(21)三氯化锑 (Carr-Price试剂 ):检查甾体 , 萜类 , 皂类 .喷洒剂 : 25 克三氯化锑溶于 75 克氯仿中 ( 亦可以用氯仿或四氯化碳的饱和溶液喷洒后

35、处理 : 100 加热 5 分钟 , 于紫外线荧光分析灯下检示荧光.).(22) 五氯化锑 : 检查甾体 , 萜类 , 皂甙 .喷洒剂 :五氯化锑 - 氯仿或四氯化碳 (1:4),用前新鲜配制 .喷洒后处理 : 120 加热至斑点出现 , 并于紫外线荧光分析灯下检示.(23) 香兰醛 - 硫酸: 检查高级醇类 , 酚类 , 甾体 , 萜类, 芳香油 .喷洒剂 : 1 克香兰素溶于 100 毫升浓硫酸 , 或 0.5 克香兰醛溶于 100 毫升硫酸 - 乙醇 (4:1) 中.喷洒后处理 :室温或 120加热观察显色斑点 .(24) 4- 二甲氨基苯甲醛 , 醋酸 , 磷酸 (E.P. 试剂 ):

36、 检查 ? Azulene 及 ? 前体 Proazulene.喷洒剂 : 0.25 克 4- 二甲氨基苯甲醛 , 溶于 50 毫升醋酸 5 克 85磷酸和 20 毫升水的混合液中 ( 棕色瓶中保存数月 )?: 烃室温即成蓝紫色斑点 , 前体于 80加热 10 分钟出现蓝紫色斑点 .(25) 氯胺 T三氯醋酸 : 检查强心甙 . 喷洒剂 : I. 3% 氯仿 T 水溶液新鲜制备 .II. 25% 三氯醋酸乙醇溶液 ( 能保存数天 ). 10 毫升 I 加 40 毫升 II, 用前混合 .喷洒后处理 : 110 加热 7 分钟 , 紫外线荧光分析灯下检示呈蓝色或黄色荧光.(26) 亚硝酸基铁氰化

37、钠 - 氢氧化钠 (Legal 试剂 ): 检查不饱和内酯 ; 甲基酮或活性次甲基 , 常用于强心甙喷洒剂 : 1 克亚硝基铁氰化钠溶于 100 毫升 2N氢氧化钠 - 乙醇 (1:1) 的水溶液 . 显红色或紫色斑点 .(27) 3,5- 二硝基苯甲酸 (Legal 试剂 ): 检查强心甙 , , - 不饱和内酯 .喷洒剂 : 1 克 3,5- 二硝基苯甲酸溶于 50 毫升甲醇 , 加入 1N 氢氧化钾 50 毫升 . 强心甙呈紫红色斑点 .糖类(28) 邻苯二甲基苯胺 : 检查还原糖 .喷洒剂 : 0.93克苯氨 ,1.66克邻苯二甲酸溶于100 毫升水饱和的正丁醇中 .喷洒后处理 : 1

38、05 加热 10 分钟 .(29) 2,3,5-Triphenyl-tetrazoliumchloride：检查还原糖及其他还原物质。溶液 I ：4（）甲醇溶液；溶液 II ： 1N氢氧化钠。喷洒液： I ， II ，临用前等体积混合。喷洒后处理： 100加热 510 分钟，得红色斑点。（ 30）Keller-Kiliani试剂：检查 去氧糖，常用于强心甙。试液： 100 毫升冰醋酸加三氯化铁试液0.5 毫升混合均匀 .试样 1 毫克加试液 2 毫克溶解后 , 沿试官管壁滴入浓硫酸 2 毫升 , 接触面即显棕色 , 渐变浅绿 , 蓝色 . 最后冰醋酸层全部燃呈蓝色 .(31) 1,3- 二羟基

39、萘 - 磷酸 : 检查糖类 .喷洒液 : 0.2%1,3- 二羟基萘 (Naphthoresorcinol) 乙醇溶液 100 毫升 , 与 10 毫升85%磷酸混合 .(32)费林溶液 (Fehling):检查还原糖 .溶液 I: 69.3克结晶硫酸铜溶于1000 毫升水中 .上述二溶液如不清可滤过. 临用前等体积混合 .氨基酸(33) 茚三酮 : 检查氨基酸及氨基糖 .喷洒剂 : 0.3 克茚三酮溶于 100 毫升正丁醇 , 加入 3 毫升醋酸 ; 或 0.2 克茚三酮溶于 100 毫升乙醇 ( 或丙酮中 ).喷洒后处理 : 110 加热至斑点出现 .(34) 吲哚醌 : 检查氨基酸和一些

40、肽 .喷洒剂 : 0.2% 吲哚醌 (Isatin) 丙酮溶液 , 含 4%醋酸 ; 或用 100 毫升 1%吲哚醌丙酮溶液加 10 毫升醋酸 .喷洒后处理 : 100110 加热 10 分钟 .(35) 1,2-萘醌 -4- 硫磺酸 (Folin试剂 ):检查氨基酸喷洒剂 :新鲜制备 0.02 克 1,2- 萘醌 -4- 磺酸钠 , 溶于.100 毫升5%碳酸钠中 .喷洒后处理 :室温放于 , 不同氨基酸出现不同颜色.有机酸(36) 酸碱指示剂 : 检查有机酸 .喷洒剂 : 0.05% 溴酚蓝 ( 或溴甲酚绿 , 或溴麝香草酚蓝 ) 的乙醇溶液 .(37) 氧化还原显色剂 : 检查有机酸 .

41、喷洒剂 : I. 0.075%溴甲酚绿及 0.025%溴酚蓝的无水乙醇液 .II. 0.5%高锰酸钾及 1%碳酸钠 .10H2O的蒸馏水液 . 临用前 , 取 I 和 II 按 1:1 混合后喷酒 .喷酒后处理 : 稳定时间为 510 分钟 . 对不同的有机酸在纸谱上呈现不同颜色 .(38) ? (Acridine): 检查酸 . 喷洒剂 : 0.005% 的?乙醇溶剂 .紫外线分析灯下呈黄色荧光 .(39) 芳香胺 - 还原糖 : 检查酸 .喷洒剂 :芳香胺 ( 如苯氨 5 克 ) 和还原糖 ( 如木质糖 5 克) 溶于 50%含水乙醇中 .喷洒后处理 : 125130 加热出现棕色斑点一、

42、通用试剂1、碘试剂检查一般有机化合物。（ 1）碘蒸气 预先将盛有碘结晶的小杯置于密闭的玻璃容器内， 使容器空间被碘蒸气饱和，将薄层置于容器内数分钟即显棕色斑点。 有时，于容器中加放一小杯水，增加容器内的湿度，可提高显色的灵敏度。（ 2） 0.5 碘的氯仿溶液 喷洒试剂，置空气中待过量的碘挥发后，喷 1淀粉溶液，斑点由棕色转为蓝色。2、硫酸试剂检查一般有机化合物。5硫酸乙醇溶液作为色谱显色剂用。喷洒后，置空气中干燥 15min，100烤至斑点呈色（不同化合物呈不同颜色） 。3、重铬酸钾硫酸试剂检查一般有机化合物。5g 重铬酸钾溶于 l00ml40 硫酸中。喷该试剂后， 150加热至斑点出现 (

43、不同化合物呈不同颜色 ) 。4、磷钼酸试剂检查还原性成分。5磷钼酸乙醇溶液。喷洒后，120加热至呈蓝色斑点。5、磷钨酸试剂检查还原性成分20磷钨酸乙醇溶液。喷洒后，120烘烤，还原性物质呈蓝色斑点。6、硝酸银氢氧化铵试剂检查还原性成分。溶液 I ：0.1mol L 硝酸银溶液。溶液： 10氢氧化铵溶液。临用前溶液 I 和以15 混合。喷洒后 105加热 5l0min ，至深黑色斑点出现。7、中性高锰酸钾试剂检查易还原性成分。0.05 高锰酸钾溶液。喷洒后粉红色背景上显黄色斑点。8、碱性高锰酸钾试剂检查还原性成分。溶液 I ：1高锰酸钾溶液。 溶液：5碳酸钠溶液。溶液 I 和等量混合使用，喷洒后

44、，粉红背景上显黄色斑点。9、四唑蓝试剂检查还原性成分。溶液 I ：05四唑蓝甲醇溶液。溶液： 25氢氧化钠溶液。临用前两液等量混合。喷洒后，微热或室温放置显紫色斑点。10、荧光素溴试剂检查不饱和化合物。溶液 I ：0.1g 荧光素溶于 l00ml 乙醇中。溶液：5g 溴溶于 l00ml 四氯化碳中。先喷洒溶液 I ，然后将薄层板放入盛有溶液的缸内，黄色斑点出现后，于紫外光灯下检视，红色底板上显黄色荧光斑点。11荧光显色试剂检查一般有机化合物。（ 1） 0.2 2，7- 氯荧光素乙醇溶液。（ 2） 0.01 荧光素乙醇溶液。（ 3） 0.1 桑色素乙醇溶液。（ 4） 0.05 罗丹明 B 乙醇溶

45、液。喷洒任一溶液，不同的化合物在荧光背景上可显黑色或其它荧光斑点。二、苷类鉴定试剂1、糖鉴定试剂（ 1） 萘酚硫酸试剂检查还原糖。溶液 I ： 10 萘酚乙醇溶液。溶液：硫酸。取 lml 样品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液 I 2 3 滴，混匀，沿试管壁缓缓加入少量溶液，二液面交界处产生紫红色环为阳性反应。 15 萘酚乙醇溶液 21m1、硫酸 13ml、乙醇 87ml 及水 8ml 混匀后使用。喷洒于薄层板上， 100烤 3 6min，多数糖显蓝色，鼠李糖显橙色，所显颜色于室温可稳定 2 天 3 天。（ 2）斐林试剂检查还原糖。 溶液 I ：6.93g 结晶硫酸铜溶于 l00ml 水中。溶液：

46、 34.6g 酒石酸钾钠、 10g 氢氧化钠溶于 l00ml 水中。取 lml 样品热水提取液，加入 45 滴用时配制的溶液、等量混合液，在沸水浴中加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。如检查多糖和甙，取 lml 样品水提液，加入 lmll0 盐酸溶液，在沸水浴上加热 l0min ，过滤，再用 10氢氧化钠溶液调至中性，按上述方法检查还原糖。（ 3）氨性硝酸银试剂检查还原糖。硝酸银 1g，加水 20ml 溶解，小心滴加适量氨水，边加边搅拌，至开始产生的沉淀将近全部溶解为止， 过滤。取 lml 样品的水溶液，加入 lml 试剂，混匀后，40微热数分钟，管壁析出银镜或产生黑色沉淀为阳性反应。 本试

47、剂也可作为色谱显色剂，喷洒后于 110加热数分钟，显棕黑色斑点为阳性反应。还原性物质如醛类、邻二酚类等有干扰。（ 4）茴香醛硫酸试剂检查糖类化合物。硫酸 lml 加到含茴香醛 0.5ml 的乙酸溶液 50ml 中，需临用前配制。喷洒于薄层板上， 105加热至显示色斑，不同糖显不同颜色。（ 5）苯胺邻苯二甲酸试剂检查糖类化合物。苯胺 0.93g 和邻苯二甲酸 1.66g 溶于 100ml 水饱和的正丁醇中。作色谱显色剂用。喷后 105烤 5min，显红棕色斑点。（ 6） l,3 二 羟基萘酚磷酸试剂检查酮糖、醛糖。0.2 1， 3- 二羟基萘酚乙醇溶液50ml 与 85磷酸 50ml 混合均匀后

48、使用。喷后 105烤 5min10min，酮糖呈红色，醛糖显淡蓝色。（ 7）苯胺二苯胺磷酸试剂检查糖类化合物。苯胺 4ml、二苯胺 4g 及 85磷酸 20ml 溶于丙酮 200ml 中。喷洒于薄层板上， 85 加热 10min，不同糖显不同颜色。（ 8） 2， 3， 5三苯基氯化四氮唑 (T T C)试剂检查还原糖。溶液： 4TTC 甲醇溶液。溶液： 4氢氧化钠溶液。临用时将溶液和等体积混合。喷洒后， 100加热 510min，显红色斑点为阳性反应 ( 醛类无干扰)。（ 9）三氯化铁冰醋酸 (K K)试剂检查 去氧糖，常用于强心甙。溶液 I ：1三氯化铁溶液 0.5ml ，加冰醋酸至 l00

49、ml 。溶液：硫酸。取样品乙醇提取液 lml ，置试管中，水浴上蒸去乙醇，残渣用 0.5ml 溶液 I 溶解，沿试管壁缓缓加入溶液 lml ，静置分层，上层渐显蓝色，下层显红色或棕色为阳性反应 ( 其颜色随苷元羟基和双键的位置和个数不同而不同 ) 。（ 10）占吨氢醇试剂检查 去氧糖 ( 常用于强心甙 ) 。10mg占吨氢醇溶于 100ml 冰醋酸中，再加入 lml 硫酸混合。取 lml 样品，加入试剂 lml ，置水浴上加热 30min，显红色为阳性反应。（ 11）Gregg-Gisvold 试剂检查 26去氧糖。溶液 I ：10三氯化铁溶液。 溶液： 1盐酸甲醇溶液 (97.2ml 甲醇中

50、含 28ml盐酸 ) 。0.5ml 溶液 I 与 100ml 溶液混合。将样品的乙醇溶液点于滤纸片上，晾干后，喷洒上述混合试剂， 110加热 5min，显蓝色为阳性反应。（ 12）3，5二氨基苯甲酸磷酸试剂检查 2去氧糖。3，5二氨基苯甲酸二盐酸盐 1g 溶于 80磷酸 25ml，加水稀释至 60ml。喷洒后， 100加热 15min，2去氧糖在日光下显棕色，在紫外光下显黄绿色荧光。（ 13）对硝基苯胺过碘酸试剂检查去氧糖。溶液 I ：饱和偏高碘酸溶液1 份加水 2 份混匀。溶液： 1对硝基苯胺乙醇溶液 4 份与盐酸 1 份混合。先喷溶液 I ，放置 10min，再喷溶液，去氧糖显黄色，紫外光

51、下显强荧光，再喷 5氢氧化钠甲醇溶液，颜色转绿，乙二醇同样显色。2、酚类鉴定试剂（ 1）三氯化铁试剂检查酚类化合物、鞣质。15三氯化铁水溶液或乙醇溶液， 加盐酸酸化。 取 1m1样品的乙醇溶液， 加入试剂 12 滴，显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用，喷洒后，显绿或蓝色斑点为阳性反应。 （ 2） 4氨基安替匹林铁氰化钾 (Emerson) 试剂检查酚羟基对位无取代基的化合物。溶液 I ： 2 4氨基安替匹林乙醇溶液。溶液： 8铁氰化钾溶液。作色谱显色剂用，先喷洒溶液 I ，再喷洒溶液，用氨气熏，显橙红或深红色斑点为阳性反应。（ 3） Gibbs 试剂检查酚羟基对位无取代基的化合物。溶液 I ：0.5 2，6溴 ( 氯 ) 苯醌氯亚胺的乙醇溶液。溶液： 1氢氧化钾乙醇溶液。取 lml 样品的乙醇溶液，滴加溶液，使 pH910，再加入 1 滴 2 滴溶液 I ，显深蓝色为阳性反应。（ 4）铁氰化钾三氯化铁试剂检查酚类、芳香胺类及还原性物质。溶液 I ：1铁氰化钾溶液。溶液：2三氯化铁溶液。临用前等体积混合。喷洒后酚性成分呈蓝色斑点，再喷 2