血管内皮细胞抗汉坦病毒的固有免疫

1、血管内皮细胞抗汉坦病毒的固有免疫    Answer a fool according to his folly.                   作者：王平忠, 王九平, 白雪帆, 贾战生, 黄长形, 姜泓 【关键词】  血管内皮细胞; 汉坦病毒; 固有免疫汉坦病

2、毒（Hantavirus, HV）包括引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）的汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）、汉城病毒（Seoul virus, SEOV）、普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）、多布拉伐病毒（Dobrava virus, DOBV）和引起汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome,

3、 HPS）的辛诺柏病毒（Sin nombre virus, SNV）、 纽约病毒（New York virus, NYV）、 牛轭湖病毒（Bayou virus, BAYV）、安第斯病毒（Andes virus, ANDV）以及与人类关系尚不清楚的一组病毒, 如希望山病毒（Prospect Hill virus, PHV）、图拉病毒（Tula virus, TULV）等。其中, HTNV和SEOV

4、分别是我国姬鼠型（型）和家鼠型（型）疫区HFRS的主要流行毒株, 严重危害我国人民的生命健康。研究表明, HV主要感染血管内皮细胞（vascular endothelial cell, VEC）导致通透性增加, 血浆外渗, 但不引起直接的细胞病变, 提示HV诱导的免疫反应是内皮细胞功能失调及HV致病的主要环节。固有免疫（innate immunity）作为机体抗感染免疫的第一道防线, 主要在获得性免疫(adaptive immunity)活化前, 发挥抗感染作用()。近年,&

5、#160;血管内皮细胞抗HV固有免疫取得了重要进展。1  血管内皮细胞的特点Children and fools cannot lie.      血管壁由内向外分为内膜、中层、外膜。内膜主要为内皮细胞, 中层以平滑肌细胞为主, 外膜则是一层较薄的结缔组织。内皮是人体最广泛存在的组织细胞, 为多角形单层扁平上皮, 覆盖于血管内表面, 与其下层疏松结缔组织构成血管的内膜层。细胞的内侧面与血液相邻, 表面带有负电荷, 以防止血细胞聚集。电镜下可见内皮细胞含有非

6、常发达的高尔基体、粗面内质网和滑面内质网, 它们是内皮细胞具有合成和分泌功能的主要结构基础, 例如内皮细胞可以合成和分泌内皮素、血管紧张素、 内皮源性舒张因子（如NO）、细胞因子和趋化因子（如IL1、IL6、 IL8、IP10、RANTES）等1, 参与血管张力和免疫调节。其次, 内皮细胞胞质富含质膜小泡（吞饮小泡）, 这些小泡由细胞游离面或基底面的细胞膜内凹形成, 然后与细胞膜脱离, 经细胞质移向对侧, 又与细胞膜融合, 将小泡内的物质释出细胞外, 故小泡有向血管外输送物质

7、的作用(医药学/临床医学论文 )。此外, 内皮细胞具有特征性的窗孔结构, 主要见于毛细血管的内皮细胞, 它们是血管腔与内皮间隙的细小通道, 对提高毛细血管内皮通透性具有重要意义。因此, 血管内皮细胞具有重要的生理和免疫功能。2  血管内皮细胞抗HV固有免疫反应    HV主要感染血管内皮细胞, 引起血小板减少、全身小血管和毛细血管广泛损伤以及血管内皮细胞肿胀变性等主要病理改变。近年来, 血管内皮细胞抗HV固有免疫研究取得了重要进展。在HV感染的内皮细胞发现:

8、0;HTNV或SNV感染HMVECLs（人肺微血管内皮细胞）, 引起IRF3（干扰素调节因子3）和IRF7向细胞核移位, 诱导趋化因子RANTES和IP10表达2。RANTES和IP10是单核白细胞的主要趋化因子, 研究表明, IP10在抗病毒感染的Th1免疫应答形成中具有重要作用3。在HFRS和HPS, 也发现具有Th1免疫应答4。致病（HTNV、NYV1）和非致病汉坦病毒（PHV）感染的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）, 在感染早期（第1天）即表现出基因转录诱导的差异（如PHV诱导47个基因转录, NYV1诱导2个基因转录

9、, HTNV仅诱导1个基因转录）。而感染晚期（第4天）转录应答类似, 可引起干扰素刺激基因（ISG）, 如OSA（寡腺甙酸合成酶）、MxA、IRF等的转录。但不同病毒能诱导细胞产生各自独特的抗病毒效应分子, 只有HTNV能诱导IFN、IL8、IL6、GMCSF、GCSF、IL7R、 Cox2（环氧合酶）等的分泌5。这些细胞因子/趋化因子是中性粒细胞和淋巴细胞的强趋化剂, 它们可能改变血管的完整性, 从而导致发病。可能正是对HV应答的这些细胞因子的差异, 在临床和病理生理方面使HFRS不同于HPS。HTNV和TULV

10、感染的HUVEC均可表达MHC类分子。然而, 感染TULV后, 能更快地上调类分子表达。在这两种病毒中, 只有HTNV能诱导产生高水平的IFN, 但都不能诱导IFN分泌。此外, 感染TULV后16h, 可诱导抗病毒MxA蛋白的表达, 而感染HTNV后48 h才有MxA表达6。MxA在内皮细胞中的延迟诱导可能有利于病毒的复制和传播。用活的或紫外灭活的SNV感染HUVEC后, 发现宿主干扰素诱导基因及其相关基因（如IRF、ISG、MxA、OSA等）, 在感染早期（第1天）具有类似的基因表达谱,

11、60;但对灭活SNV的应答超过对活SNV的应答; 而在感染晚期（第3天）则相反, 表明SNV诱导先天性免疫应答基因的表达, 不需要病毒复制7。灭活病毒被宿主识别的机制尚未完全阐明, 可能与宿主对病毒糖蛋白的识别和（或）通过宿主细胞受体如模式识别受体(pattern recognition receptors, PRR)的信号转导有关8。上述研究表明, HV感染血管内皮细胞后, 可诱导特异性基因表达, 分泌细胞因子/趋化因子, 产生抗病毒作用。3 血管内皮细胞抗病毒固有免疫的分

12、子机制    内皮细胞不仅是机体重要的屏障和半透膜, 而且具有重要的代谢和内分泌功能。血管内皮对环境及促炎症活化信号的反应可影响和指导免疫应答, 导致细胞因子、 趋化因子和细胞黏附分子（CAM）的局部表达, 有助于循环的免疫细胞募集至损伤、炎症或病毒感染的部位。病毒感染能以多种方式导致血管内皮细胞的变化, 例如, 间接通过感染的或活化的淋巴细胞, 触发促炎症淋巴因子的合成和局部释放, 或者在免疫介质缺乏时直接诱导细胞因子、 趋化因子和CAM在内皮细胞中的表达变化,&

13、#160;来诱导内皮细胞活化。大多数病毒感染都能被宿主先天性免疫和获得性免疫系统清除。先天性免疫应答是防御入侵病原体的第一道防线, 其主要标志是型干扰素（IFN/）的合成和分泌。触发有效抗病毒先天性免疫应答需两个条件: 一是通过细胞模式识别受体（PRR）感受入侵的病毒, 二是调节干扰素合成的蛋白级联信号转导通路的启动。目前已发现两类PRRs与固有免疫有密切关系, 即Toll样受体（Tolllike receptor, TLR）和视黄酸诱导基因（retinoic acid inducible gene,&#

14、160;RIG）。这些受体位于细胞的不同部位, 识别不同的配体（病原体相关分子模式: pathogenassociated molecular patterns, PAMP）。在获得性免疫形成前, PAMP诱导细胞内信号转导, 产生型干扰素（IFN/）等固有免疫反应, 以抵抗病毒的侵袭。    Toll样受体（TLR）属型跨膜蛋白, 由胞外区（550-980个氨基酸）、跨膜段和胞内区（约130个氨基酸）3部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列（LRRs）, 能

15、识别病原体成分; 胞内区有一个Toll/IL1R(TIR)区域, 是高度保守的蛋白质相互作用区, 通过与转接分子的相互作用转导信号。迄今, 已发现11种TLRs, 它们在细胞内均有一定的分布。TLR1、2、4、5、6表达于细胞表面, TLR3、7、8、9存在于细胞的胞内体（endosome）。体内的大多数细胞至少表达一类TLR, 如血管内皮细胞可高水平表达TLR49。TLRs对病原体成分的识别有明确的“分工”: TLR1/TLR2异二聚体识别三酰基脂肽; TLR2/TLR6异二聚体识别二酰基脂肽;

16、0;TLR4识别细菌脂多糖(LPS); TLR3感受双链RNA分子（dsRNA）; TLR5识别鞭毛虫的鞭毛蛋白（flagellin）; TLR7/8是单链RNA（ssRNA）的识别受体; TLR9的配体是含未甲基化CpG基序的细菌DNA; 最近鉴定的TLR11感受引起膀胱和肾脏感染的细菌10。因此, 不同的TLRs可识别不同的病原体结构成分。对病毒而言, 已发现4种PAMPs: 双链RNA（dRNA）、 CpG、单链RNA（ssRNA）和包膜糖蛋白。TLRs被PAMPs活化后, 导致特异性转接

17、蛋白MyD88（髓样分化因子88）募集至TLRs的胞内区, 与IL1受体相关激酶（IRAK）结合。然后, 肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）被募集并与IRAK相互作用, 导致下游NFB诱导激酶（NIK）和IB激酶（IKK）活化。IKK介导NFB抑制剂（IB）的磷酸化, 随之IB降解, 使NFB发生细胞核移位。大多数TLRs均通过这条途径转导信号（MyD88途径）。然而, TLR3或TLR4与PAMPs相互作用, 招募另一转接蛋白（Toll/IL1 receptor domaincontaining&

18、#160;adaptor inducing IFN, TRIF）, 使IFN调节因子3（IRF3）和（或）NFB活化（TRIF途径）（图1）。  上述两条途径的最终效应是导致特异性基因表达和细胞因子/趋化因子的分泌, 产生抗病毒固有免疫作用。Beg from beggers and you'll never be rich.      视黄酸诱导基因（RIG）是近年发现的细胞内病毒双链RNA（dsRNA）（单链RNA复制的中间体）的受体11。它是DExD/H box&

19、#160;RNA解旋酶蛋白家族的一个成员。RIG解旋酶结构域能结合合成的dsRNApoy(IC)和病毒dsRNA。除C端解旋酶结构域外, N端还含有2个串联的半胱天冬酶募集结构域（CARDs）。含2个CARDs的RIGN端的过度表达, 在缺乏病毒刺激时就足以活化NFB和IFR3, 而全长的RIG仅在dsRNA存在时被活化。因此, dsRNA结合至RIG的RNA解旋酶结构域可能诱导N端CARDs结构域的构象变化, 以募集下游信号转导蛋白。RIG在抗病毒免疫中的作用首先被RNA干扰（RNAi）和小鼠基因敲除研究证实11, 12。L929细

20、胞系（一种小鼠成纤维细胞系）的RIGRNAi在对RNA病毒的应答中, 不仅抑制IRF3活化, 而且抑制后来的型IFN的诱导。RIG基因敲除小鼠的胚胎表现出严重的肝脏退化, 并且大多数都是胚胎致死的。RIG突变小鼠致死表型的机制尚不明确, 但在小鼠胚胎成纤维细胞和肺成纤维细胞中, 已表明RNA病毒对IFN和ISGs的诱导被终止。用IFN预处理RIG缺陷的成纤维细胞系可增加对水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）的抗性, 提示RIG是IFN诱导必需的, 且不

21、影响IFN下游信号转导途径。    最近, 4个研究小组独立地鉴定了RIG下游的一个CARD结构域13-16, 这个蛋白现在统一命名为线粒体抗病毒信号转导蛋白（mitochondrial antiviral singaling protein, MAVS）。MAVS在抗病毒信号转导中具有重要作用: MAVS的过度表达导致IRF3和NFB的活化, 从而产生型IFN; MAVS的表达被RNAi沉默后, 可以废除由病毒和RIG过度表达引起的IFN诱导; 

22、;在MAVS表达缺乏时, 与IRF3、 NFB活化有关的激酶不能被激活; MAVS的过度表达可防止VSV引起的细胞病变, 而MAVS的RNAi使细胞对病毒更易感。MAVS具有上述作用的原因是它是连接RIG与IKK和TBK1的一个重要的转接分子。但MAVS如何被RIG调节？它又如何活化下游激酶？线粒体在活化IKK和TBK1中有何作用？这些问题目前仍不清楚。但MAVS在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）研究领域获得了重要突破。Li等17研究表明, HCV NS3/4A能结合并与MAV

23、S在线粒体膜上共定位, 体外NS3/4A可直接切割MAVS, 而MAVS的Cys508突变, 能防止对它的切割, 并恢复IFN诱导。Meylan等16的研究也表明, 转染的MAVS在HCV感染的肝细胞中被切割。因此, HCV NS3/4A对MAVS进行切割, 与线粒体分离, 麻痹宿主的免疫系统, 这可能是HCV持续感染的原因之一。    HV是有包膜的单股负链RNA病毒, 基因组包括L、M、S3个片段, 分别编码RNA依赖的RNA聚合酶

24、、包膜糖蛋白（G1, G2）和核蛋白（NP）。HV感染引起的内皮细胞信号转导调节和细胞防御应答的报道很少。HV有3种细胞质蛋白, 即多聚酶、 核蛋白和G1细胞质尾（142个氨基酸残基）, 它们有调节先天性免疫应答的能力。Alff等18研究发现, 致病（NY1V、HTNV）和非致病（PHV）HV感染血管内皮细胞后1d, IFN特异性转录应答存在明显差异。进一步研究证实, NY1V G1细胞质尾的表达可抑制RIG和TBK1（TANK结合激酶1）引导的IFN应答, 但不能抑制IRF3引导的IFN转录, 

25、;表明G1尾在TBK1复合体水平, IRF3磷酸化的上游调节细胞IFN应答。TBK1是RIG和TLR4信号转导途径中一个重要的激酶, 活化的TBK1引导IRF3磷酸化和NFB活化, 使其发生细胞核移位, 诱导型IFN的分泌19。RIG和TLR是不重复的2条途径, 在不同细胞介导抗病毒信号转导。然而, HV感染诱导先天性免疫应答是通过RIG还是TLR传递信号, 目前尚不清楚。4  结语    VEC不仅是机体内重要的屏障和半透膜, 而且具有重要的代谢和内分泌

26、功能。HV主要感染VEC, 引起血小板减少、 全身小血管和毛细血管广泛损伤以及VEC肿胀变性等主要病理改变, 导致HFRS患者血管通透性增加, 血浆渗漏。诸多研究表明, 上述变化与HV诱导的免疫反应有密切关系。PRR是联系固有免疫与适应性免疫的桥梁, 近年VEC抗HV固有免疫虽已取得了重要进展, 但HV识别的PRR及其信号转导途径尚不清楚。因此, 以VEC为靶细胞深入研究抗HV免疫反应, 对阐明HV感染致病的分子机制, 研制新型疫苗和治疗药物具有重要的意义。【参考文献】  1

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