铜绿假单胞菌疫苗研究进展.docx

1、文章编号：1002-2694(2010)12-1157-03铜绿假单胞慵疫苗研究进展来佑明.罗永艾中图分类号:R378.99-1文献标识码：A铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaPa)是常见的非发醉糖(；专性需H小杆菌.广泛存在于土壤、水、污物、植物和动物中.常定植于健康人的上呼吸道、肠道和皮肤等处.是免疫抑制个体重要的机会致病偏。铜绿假单胞菌感染一旦发生.多为慢性病程.引起肺实质损伤.常导致患者死亡。由于铜绿假单胞菌膜对药物渗透障碍.引起多种抗生多天然耐药。在治疗过程中，通过基因突变发生耐药,使铜绿假单胞函感染治疗卜分棘F.死亡率高，疫苗是预防感染性疾病发牛的有效方法本文

2、介绍了6种Pa疫苗构建及其免疫机制等方而的研究进展1灭活疫苗灭活疫苗(inactivcdvaccine)乂称为死疫苗是病原休大量培养以后.经理化方法灭活后制成OCripps等应用lioehringer-Ingelheim制备的低压冷冻甲醛灭活的15385株(2血清型、21/44/109/1IOX/1214噬御体型肠溶口服疫苗Pseudostat.每粒150mg.含2Xl()n(、FU°1d、28d给予健康志愿者15()mg服免疫.末次免疫后观察2w.安全性艮好。在免疫14d后.血清特异性的IgA抗体明显增加,持续到42d：血清持异性的IgM抗体也明显增加.28d恢复正常；在整个观察期

3、IgG无明显变化.提示疫苗不能很好诱导Thl型免疫反应：免疫血清能明显增加巨喋细胞的调理吞噬作用。2减毒活疫苗减推活疫苗(live-attcnualedvaccine)是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。aroA基因编码5-烯醇酮芥草酸三磷酸合成的.是植物和细闲合成芳香族敏瑞酸的关键前。Prichc等m用l0MCFU,5X10TFU和lOH'FUPAOlAaroA减毒活疫苗依次递增鼻腔免疫C3HHcN和BALB/c小鼠，1次/w.共3次，未出现茬性反应.一1d后肺部是无菌的。末次免疫3w后用ExoUPAO1和()2/05血清型PAO1攻击.全部小鼠存活.3d后对照组全部死亡：用不同血清

4、型攻击疫苗组.未能得到好的保护率；不同类近交小鼠产生的保护率不同；与对照组相比在疫苗蛆ExoUPAO1引起的气道急性炎症明显减轻.能维持正常的肺泡结构：腹腔注射1n*来源于卵腔接种0.25mg疫苗小鼠的IgG抗体,在低于主动免疫PAOlAaroA疫苗免疫剂量组有高水平的保护力。Zaidi等用同样减毒活疫苗依次递增鼻腔免疫C3H/HeN小鼠.1次/'w.共3w°末次免疫4w后.用4000倍ID："50%infectiousdose,IDG的不同血清型和不同毒力的铜绿假单胞菌攻击均没有观察到眼睛的病理损伤直至7w仍有显著保护力。在被动免疫研究中,不同血清型和不同毒力的铜

5、绿假单胞萌划伤感染眼结膜，在感染前18h和感染后2h腹腔注射鼻腔免疫PaOlAaroA减毒活疫苗的血清，均获得显著保护性：用不同血清型铜绿假单胞菌1.4XIO；CFU角膜感染后3d,腹腔注射鼻腔免疫PaOlAaroA减毒活疫苗的小鼠血清.仍能明显减轻角膜的病理损伤；证实Pa()1AaroA减毒活疫苗血清不仅有抗菌活性,而且能阻止铜绿假单胞菌进入角膜上皮细胞，研究结果提示减毒活疫苗是安全有效的.同-疫苗对不同部位的S感染，保护力不同。3结合疫苗结合疫苗(conjugatevaccine)是将多糖等T细胞非依赖性抗原与蛋白载体结合制成。黏液胞外多糖(mucoidexopolysaccharide.

6、MEP).又称为藻酸盐.是由I)-甘露糖醛酸和1厂占洛糖酸酸通过阡4糖甘连接形成的多聚物9Pier等'发现MEP免疫小鼠后能够产生调理性抗体.有利于呼吸道清除铜绿假单胞菌.但是,单纯的MEP疫苗诱导产生抗体不足10%。Theilacker161成功制备KLH-MEP结合疫苗.最佳免疫剂虽是1邱/只.免疫03H/HcN小鼠,诱导出高浓度MEP特异的IgM和Ig(；抗体，也(；在第2次免疫7d后开始增加.第3次免疫后显著增加，35d达高峰、持续到63d。高剂量:的MEP和KLH混合物免疫后仅产生MEP特异的也M和KLH特异的IgG抗体，并不产生MEP特异的lg(；抗体,提示KLH是良好的T

7、细胞非依赖性抗原结合载体。陆淼泉等将MEP与R群脑膜炎球菌外通讯作者:费永艾.Email:luoyongai19-12(«作者单位：正庆医科大学附属第一医浇府唆内科.重庆400016膜蛋白复合物(OMPC)通过Hurwitz方法交联成功制备MEP-OMPC结合疫苗。1d、7d和14d免疫小鼠3次每次50昭/只.2Id和28d诱导产生高水平抗MEP的调理性IgG抗体；29d用1X10，CFU黏液型铜绿假单胞菌腹腔攻击的保护率85%.能有效预防铜绿假单胞菌的全身感染。4DNA疫苗DNA疫苗(DNAvaccine)是将编码病原体有效免疫原基因插入质粒构建重组体.经过注射等途径进入机体.转染

8、宿主细胞，表达保护性蛋白抗原.诱导产生特异性免疫。陈建国等将铜绿假单胞圜OprF3个中和性3细胞表位和1个外源通用T细胞表位串联，采用重蒲PCR方法合成DNA./E此序列前插入组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽基因将获得的片段与MyD88基因分别克隆到PIKES载体的两个多克隆位点.构建苴核双表达重组质粒pIRES-tPA-()prF-MyI)88o将该疫苗50“g/次，间隔2w.免疫3次，末次免疫2w后采血检测抗体，疫苗组产生高水平的OprF特异性抗体，机体清除铜绿假单胞【有的能力明显增强。Price等w将长度为977bp的oprF基因亚克隆入页核表达质粒PVR1020纤溶醉原信号序列的F

9、游.在大肠杆萌中扩增，成功构建|)VR1020/oprF基因疫苗。于0d、14d和28d,pVR1020/oprF基因疫苗(2pg/只)免疫ICR小鼠.末次免疫2w后收集血清检测，主要是lgGl0Ig(；l/IgG2a为10.33.提示是Th2型免疫反应,有利于抗体产生：用琼脂包埋7X10-CFU铜绿假单胞菌FI)4.接种在左支气管.评价疫苗对慢性感染的保护力.空载体对照蛆存在严重肺损伤小鼠比率是76.2%.细菌定tt(>5X10s)的比率是69%而疫苗组分别是43.2%和40.9%,提示保护力不高O5重组抗原疫苗重组抗原疫ft'(recombinantantigenvaccin

10、e)是利用DNA页组技术制备仅含保护性抗原的纯化疫苗。Mansouri等将oprF-oprl基因亚克降入大肠杆菌表达质粒.构建pTrcIlisFI重组质粒.成功表达和纯化获得分子觉为33kl)()prF炒卜:“厂()prI-K3融企蛋白疫苗°用20ug50/xgJOOMg或500倒分别免疫健康志愿者.1次/4w,共3次，观察6个月。所有疫苗组Ig(；l抗体均显著增加.50()冲组在第1次免疫后就有增加，其余组在第2次免疫后增加.提示抗体产生与接种疫苗剂量有关。实验证实疫苗组血清能增加73%接种者的调理吞噬活性。DOring等进行了Pa二价粮毛疫苗3期临床试验.该疫苗由20亚型为awa

11、ia2和20“g亚型为b鞭毛蛋白组成。肌肉注射疫苗3次.每月1次.1年后加强注射1次.产生高滴度的IgGJgA和SigA抗体；能减少66%的囊性纤维化病人感染铜绿假单胞菌。Weimer等:将Hie.oprF和oprl基因亚克隆入大肠杆菌表达质粒pET29a,成功表达OprF.,11.311-()prl-flageilins融合蛋白经实验证实，()prF.uIJ,-()prl-flagellins融合蛋白既有利于PA的清除.又能减轻继发性肺部损伤，是较理想的候选疫苗。Peluson等用来源于PAOI菌株天然OprF(native()prF,n-()prF)和pET28a-()prF在大肠杆菌B1

12、.21表达重组OprF(histidin-conjugatedOprF,His-OprF)体外剌激小鼠DCs(dcndriiiccells)，评价抗PA保护力和炎症反应。n-()prF和His-OprE刺激DCs诱导相似的共刺激分子(CD间和CU，,)和细胞因于的表达，产生高水平的】I”2p70,和低水平的IL-10以及11厂6,提示以Thl型免疫反应为主。回输被刺激DCs给C57BL/6.1W后.经鼻腔感染3X107CFUPAOI和囊性纤维.化病人分离的黏液型PA,在PAO1感染4d和7d后.n-()prF组根据细菌计数结果表明有显著保护力.His-OprF组在第4d显著减少，对照组无细偏的

13、清除；与对照组比较.局部肺组织匀浆TNF-a显著诚少JL-l2p70和IL-10增加，局部淋巴结IFN-y增加，11,-4和IL-10减少.支持局部炎症反应减轻的组织病理学的表现。在黏液型已，感染7d后，细菌清除延迟有大量细菌存在，但明显抑制细菌的生长；尽管与对照组比较,I112p70/lFN-7增加.IL-4减少，但TNFa无显著降低,炎症反应减轻程度也不及非黏液型1寿()】感染后。由此可见.疫苗的保护力与病原体的清除.炎症病理的轻重.引流淋巴结是否以Thl型免疫反应为主有关.抗体可以保护机体免受PA感染,Thl型免疫反应有利于Pa的清除。6重组载体疫苗重组载体疫苗(recombinantv

14、cciorvaccine)是将编码病原体有效免疫原的基因转入载体(常见的是减毒病毒和细慎).并能在载体中表达，随疫苗株在体内繁殖使大量抗原得以表达而制成的疫苗。DiGiandomenico等将编码PA()11血清型基因克隆入pLAFRl质粒，改称|)LPS2.经过三亲杂交转入arcA突变鼠型肠沙门氏菌减毒株SL3261.成功构建LPS沙门氏菌重组载体疫苗。用该疫苗免疫BALB/c小鼠分为口服和腹腔注射组。口服组能诱导高水平的也G和lgA,IfiG2a和1«G3明显高FIgGl和Ig(；2b.产生良好的黏膜免疫.在支气管灌洗液中也能观察到高水平的lg(i和IgA°腹腔注射组能

15、诱导产生高水平特异的IgG抗体】gG3亚类最高.但未能观察到也A的增高；也(；增高的水平是口服绢的2倍.族(；3增高的水平是口服组的4倍。Arnold等"将编码Met-Ala-(His).t-()prFl3irOprLIJU融合蛋白基因插入pMW151、pMW209和PMW210质粒Pg启动子的下游后.转入aroA突变鼠型肠沙门氏儡减毒株SL3261.口服途径免疫小鼠.SL3261(pMW151)可诱导最高水平的蛋白表达.但是未能诱导任何可检查到的系统的或黏膜的抗体；SL3261(pMW210)在小鼠的肠相关淋巴组织中有最好的感染.诱导中等程度的免疫反应.产生高水平的IgA；Sl,3

16、261(pMW2()9)可诱导高水平的IgAJg(；和lg(；2aJgGl/IgG2a分析提示以Thl型免疫反应为主。Worgall等1?将OprF蛋白的Epi1、Epi6和Epi8B细胞表位基因插入腺病毒5(Ad5)衣壳蛋白基因组中.成功构建AdZ.Epil、AdZ.Epi6和AdZ.Epi8疫苗。用1X10"pu分别免疫小鼠28d后,AdZ.EPi8组产生比AdZ.Epil和AdZ.Epi1组更高水平的抗铜绿假单胞菌IgG.再次免疫可增加7倍IgG水平。用AdZ.Epi8免疫小鼠后5w.用致死剂量(oXIO'CEU)攻击.80%的小鼠存活超过2w.对照组存活不超过48ho

17、AdZ.Epi8免疫不同的小鼠产生不同的I”；亚类.在C57HIJ6小鼠I：要是lg(；2h：在BALB/c小鼠中lg(；2h水平比Ig(i2a高；在CBA鼠中Ig(；亚类水平依次是IRG2a>Ig(；2b>lg(；3.iiE明Epi8既是B细胞表位.乂是T细胞表位cAdZ.Epi8免疫C57BI76小鼠1()d后.在小鼠脾细胞中检霞到Epi8特异性的】FN-y增加,与对照绢相比.Epi8特异性的('1)4T细胞增加】8%.('D8T细胞增加38%,证明AdZ.Epi8疫苗既诱导良好的体液免疫.又诱导产生细胞免疫是右.希望应用于临床的疫苗。综上所述.迄今为止还没有真

18、正的能阻止铜绿假单胞俯感染或能起治疗作用的疫苗面世.而M几乎所有的研究是在动物中进行的.少数在人体进行的临床试验也不尽人意.需要进步研究安全性好、保护力高的疫苗。参考文献：11.X'rippsAW.PzkKIkmklcyM.vtal.Safelyandimnuinogc-nicilyofanoraliiutciivaudwhole-rdlPseiulomoimsvarcinvcrciltohealthyhuinKiisubjcristJ3.Infvcl】mnum.2006.74(2)：968-974.C2'Priebe(»P.BrinigMM.IlatanoKvial

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20、cnuntcdaeroAckktionmutantJInfectImmun92003«71(3):1453-146LC43ZaidiTSPriebe(>P>Pier(；H.AliveattenuatedPseudoMonasacruninoavHccincelicitsoutermembraneprotein-specificactiveandpassiveprotectionagainstcornealinfrclionJInfectinrnwn.2006,71(2):975-983.5Pier(；UDesJardin【).GroutMcial.Humaniumuinc

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