鹿茸多肽对β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用

1、鹿茸多肽对淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用 作者：王旭凯 王英 杨有庚 冷向阳【摘要】 目的探讨鹿茸多肽对淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用。方法体外进行胎鼠脊髓神经元细胞培养传代，细胞进入对数生长期后进行实验。MTT比色法检测不同浓度淀粉样蛋白作用24 h后细胞活力变化；检测25molL 淀粉样蛋白作用24 h后，细胞凋亡百分数和观察细胞caspase3表达情况。结果不同浓度的淀粉样蛋白作用24 h后对细胞活力均明显下降，并呈剂量依赖性(P0.05)；鹿茸多肽可明显抑制淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡现象(P0.05)，且可使caspase3的表达量下降。结论鹿茸多肽通过

2、抑制淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞caspase3表达增高而对其细胞凋亡发挥保护作用，本实验为探索新的脊髓神经损伤的药物提供了重要的理论基础。 【关键词】 鹿茸多肽 脊髓神经细胞 细胞凋亡 淀粉样蛋白 casepase3脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是外科常见的创伤，其年发病率逐年升高。在脊髓损伤中，除了原发的物理打击因素造成神经细胞损伤外，已发现损伤区及临近部位的神经细胞存在迟发性的死亡现象，这种死亡与常见的坏死不同1，表现为一种程序性死亡（细胞凋亡），细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，降低其的表达有助于脊髓损伤的修

3、复和再生2。鹿茸系鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角3。关于鹿茸多肽混合物，近两年，有学者通过实验证明鹿茸多肽对脊髓损伤后的神经细胞有保护作用4，本实验应用鹿茸多肽作用于淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡的保护作用，以进一步阐述其对脊髓神经细胞保护作用的机理。1 实验材料与方法1.1 实验材料 15d孕鼠购自吉林大学实验动物中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自invitrogen公司；细胞培养瓶和培养板购自Castar公司；神经生长因子（NGF）购自Sigma公司；鹿茸多肽由长春中医药大学惠赠；淀粉样蛋白(A25-35)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自

4、(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.2 实验方法1.3 统计方法 应用统计分析软件SPSS14.0分析数据，数据以均数标准差(xs)表示，两两比较采用t检验，P0.05，有统计学意义。1 2 结果2.1 脊髓神经元细胞的培养及鉴定 单细胞悬液接种后第2d，细胞聚集成团状，第3d出现大量悬浮的neurosphere(约3060个细胞)，而且neurosphere越来越多。到第7d细胞胞体十分饱满，轮廓清晰，有的细胞可见明显的鸟眼状细胞核，也有的细胞伸出树枝状突起，突起相互连成。用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元。镜下观察，可见实验组细胞胞体

5、饱满，突起明显并连成网状。见图1。图1 烯醇化酶(NSE)标记神经元（略）2.2 MTT比色法检测细胞活力 MTT检测结果显示，不同浓度的A25-35（0、5、10、20、25、30molL)作用24h后，均可引起细胞活力下降，并呈一定的剂量依赖性(P0.05)。本实验选择A25-35 25mol /ml剂量进行后续实验，见图2。图2 MTT法检测A25-35细胞活力的影响（略）表1 鹿茸多肽对A诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）图3 鹿茸多肽对A诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）2.4 免疫组化检测caspase3结果 caspase3阳性细胞胞质着棕色。结果显示：对照组无caspase3阳性染

6、色的细胞；A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）组caspase3阳性细胞数减少，比单纯A（25molL）组少，其作用与NGF阳性对照组比较无差异，鹿茸多肽对脊髓细胞凋亡具有抑制作用。见图4。a 对照组b A组（25molL）c A（25molL）+鹿茸多肽（400mg/ml）d A（25molL）+NGF（20ng/ml）图4 鹿茸多肽对A（25M）诱导脊髓神经元细胞caspase3的表达的影响（略）3 讨论 脊髓损伤的是神经领域内一道尚未解决的难题，虽然人们采取了许多种方法促进损伤后的脊髓轴突再生修复，但存在许多限制因素，很难达到理想效果，许多学者进行了深入研究脊髓神经组织损伤后

7、再生不良，其重要原因是伤后继发性损害不断加重所致，而细胞凋亡是继发性损伤的关键，抑制细胞凋亡是阻止或减少继发性损伤，保护神经功能的治疗所在。细胞凋亡相关基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl2（B细胞淋巴瘤/白血病基因家族2）、p53等。Caspases家族对细胞，特别是神经元凋亡程序的启动具有核心作用。它直接水解激活与DNA断裂等凋亡特征性改变密切相关的蛋白，又称为死亡蛋白酶。迄今已发现14个家族成员，其中caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路5。因此抑制caspase3的表达是成为探索的治疗途径

8、之一。淀粉样蛋白是淀粉样前体蛋白(APP)通过一定降解途径产生的6，其主要的活性片段为A25-35，A25-35可诱导细胞凋亡，本实验利用辐射诱导脊髓神经细胞凋亡，观察鹿茸多肽对脊髓神经细胞凋亡后caspase3表达的影响。 本实验结果显示：应用A25-35诱导胎鼠脊髓神经元细胞凋亡后，在细胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通过MTT比色法检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡数目和免疫组化观察caspase3表达量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制A25-35诱导脊髓神经细胞凋亡的作用，其作用是通过调控凋亡基因的表达，即caspase3表达下调而实现的。本实验说明，鹿茸多肽主要是通过有效地降低死亡蛋

9、白酶caspase3的表达量，进而抑制脊髓神经元细胞的凋亡起到保护脊髓神经元细胞的作用。【】 1 Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injuryJ.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.2 Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injuryJ. Nature Medicine,1999, 5（8): 943946.3 王本祥,周秋丽.鹿茸的化学、药理及临床研究进展J. 药学学报,1991, 26(9) : 714720.4 冷向阳.鹿茸多肽对辐射诱导脊髓神经细胞凋亡的保护作用J.实验诊断学,2007,11(3):319321.5 Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosino