电泳仪和毛细管电泳仪

1、电泳仪和毛细管电泳仪胡水旺病理生理学教研室1第一节 电泳 带电颗粒在电场电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP) 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术电泳技术2电泳发展简史1897，Kohlausch推导出带电粒子移动的理论公式20世纪初，Hardy发现许多生物胶体粒子的迁移率取决于电解质溶液的pH值320世纪50年代，出现支持物的区带电泳80年代后期，出现毛细管电泳，芯片电泳1937年瑞典化学家Tiselius将血清蛋白分成清蛋白、1-、2-、-球蛋白（移界电泳法）+点样线诺贝尔奖4目前，电泳技术在生物大分子生物大分子

2、尤其是蛋白质和核酸的分离、分析和鉴定上具有巨大优势。生物化学与分子生物学的“常规武器”及常用工具。5电泳电泳原理原理 基本原理：基本原理： 不同的物质，由于其带电性质、颗粒不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的们的移动方向移动方向和和移动速度移动速度也不同，因此可也不同，因此可使它们分离。使它们分离。6一、电泳迁移率一、电泳迁移率（Electrophoresis mobility） 当颗粒的摩擦力与电场力相等时：F = E Q = f f摩擦系数f 带电颗粒的电场力：F = E QF+_QEL7 根据Stoke公式: 颗粒半

3、径， 介质粘度不同物质颗粒具有不同电泳速度8电泳迁移率或电泳淌度（电泳迁移率或电泳淌度（ ） = = EQ6 适用于球形带电粒子 带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度9 = = = Ed / t U / Ld L t U-+-d Ad BABdd = dA - d B = ( A- B ) t UL物质间能否分离取决于它们迁移率的差异淌度不同是HPCE分离的基础10二、 影响电泳速度的因素11等电点：蛋白质（或两性电解质）所带的净电荷为0时溶液的值。此时它们在电场中的迁移率为0。12两性电解质两性电解质：两性电解质就是既能当酸又能当碱用的电解质。两性电解质通常为两性元素的氧化物的水合物、氨基

4、酸等。电场强度 E 离子强度 I 电流强度 I I 131). 双电层pH3时，Si OH SiO -石英毛细管142).电渗流（EOF）电渗现象中整体移动着的液体电渗：电渗流：在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向一个方向移动的现象SiO-电泳缓冲液+-15电渗流方向电渗引起缓冲液从毛细管一端向另一端流动。一般方向是从阳极到阴极16电渗流形状 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。17电渗流的大小电渗流速度大于电泳速度带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度

5、的矢量和18-电泳缓冲液流动方向+-+合理利用电渗流可以使阳离子、中性分子、阴离子实现同时分离分析颗粒的电泳方向与电渗方向相同时，相对19介质对样品的滞留作用吸附作用越强，三. 电泳的分类按电压高低常压电泳：100500 V按支持介质区带电泳高压电泳：500 V自由电泳20电泳电泳方法方法 （一）纸电泳（一）纸电泳 支持载体：滤纸支持载体：滤纸21滤纸条水平架设样品点于滤纸中央滤纸被润湿盖上绝缘密封罩输入直流电压特点特点： 对蛋白质吸附小，消除拖尾现象对蛋白质吸附小，消除拖尾现象 分离速度快分离速度快 电泳时间短电泳时间短 样品样品用量少用量少22（二）醋酸纤维素薄膜电泳检测微量异常蛋白特点特

6、点：机械强度好、弹性大、透明、机械强度好、弹性大、透明、 化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、 样品量小、分辨率高样品量小、分辨率高 23（三）凝胶电泳利用利用pH值梯度介质，分离等电点不同的蛋白质值梯度介质，分离等电点不同的蛋白质24样品各组分别聚焦在各自等电点样品各组分别聚焦在各自等电点相应的相应的pH值值位置成一条清晰而位置成一条清晰而稳定的窄带。稳定的窄带。 （四）等电聚焦电泳特点：样品用量少、分辨率高 电泳速度快、加入样品的位置可意选任择 测定物质的等电点 中、大分子量生物组分的分离分析。 采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电采用两种不同浓度

7、的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的解质之间的空隙中空隙中移动，实现分离。移动，实现分离。25（五）等速电泳（五）等速电泳（六）双向凝胶电泳（二维电泳）六）双向凝胶电泳（二维电

8、泳） 26第一向：等电聚焦电泳 （IEF）根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向：凝胶电泳 （SDS-PAGE）按蛋白质分子量的大小在垂直方向进行分离。其结果现为斑点状 。27IEF流程图流程图双向电泳原理双向电泳原理第二向：第二向：SDS-PAGESDSpH梯度第一向等电聚焦PI第二向SDSPAGE凝胶分子量pHSDS-PAGEPI30双向电泳31 (七七）免疫电泳）免疫电泳32抗原样品在琼脂平板上进行电泳分离加入抗体抗体扩散中与抗原相遇并反应出现沉淀弧33第二节第二节 电泳仪的临床应用电泳仪的临床应用 一、一、 血清蛋白电泳血清蛋白电泳 新鲜血清经醋酸纤维薄

9、膜或琼脂糖电泳、染色后，新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见通常可见5 5条带，即清蛋白、条带，即清蛋白、 1 1、 2 2、 和和 球蛋白。球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。病进行诊断及鉴别诊断。 34血清蛋白电泳图谱二、尿蛋白电泳二、尿蛋白电泳 临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确定临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：确定尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度（选尿蛋白的来源；了解肾脏病变的严重程度（选择性蛋白尿

10、与非选择性蛋白尿），从而有助于诊择性蛋白尿与非选择性蛋白尿），从而有助于诊断和预后的判断。当断和预后的判断。当 不能进行肾活检时，不能进行肾活检时， 尿蛋白电泳结果能尿蛋白电泳结果能 很好地协助临床判断很好地协助临床判断 肾脏的主要损害肾脏的主要损害。 35尿蛋白电泳图谱尿蛋白电泳图谱 三、血红蛋白及糖化血红蛋白电泳血红蛋白及糖化血红蛋白电泳 应用应用电泳法鉴别患者血液中电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量，对的类型及含量，对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。Hb电电泳结果应根据不同年龄人群进行分析。泳结果应根据不同年龄人群进行分析。 36血红蛋白

11、电泳图谱四、免疫固定电泳四、免疫固定电泳 可可对各类对各类IgIg及其轻链进行分型，最常用于临床常规及其轻链进行分型，最常用于临床常规M M蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆蛋白的分型与鉴定。一般用于单克隆IgIg增殖病、单增殖病、单克隆克隆IgIg病、本周氏蛋白和游离轻链病、多组分单克病、本周氏蛋白和游离轻链病、多组分单克隆隆IgIg病、重链病、病、重链病、 CSFCSF寡克隆蛋白鉴寡克隆蛋白鉴 别、多克隆别、多克隆IgIg病的病的 诊断和鉴别诊断。诊断和鉴别诊断。37免疫固定电泳图谱免疫固定电泳图谱 五、五、 同工酶电泳同工酶电泳 同工酶电泳用于临床上常见的同工酶或同工酶同工酶电泳用于临床上

12、常见的同工酶或同工酶亚型分析。亚型分析。 1 1乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LD/LDH)(LD/LDH)同工酶：同工酶： 2 2肌酸激酶（肌酸激酶（CKCK）同工酶：）同工酶： 3 3CKCK同工酶亚型：同工酶亚型： 38 同工酶电泳图谱 六、脂蛋白电泳六、脂蛋白电泳 脂蛋白电泳检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三脂蛋白电泳检测各种脂蛋白（包括胆固醇和甘油三酯）主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计，酯）主要用于高脂血症的分型、冠心病危险性估计，以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗（包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物和治疗（包括治疗

13、性生活方式改变、饮食及调脂药物冶疗）效果观察的研究等。冶疗）效果观察的研究等。39脂蛋白电泳图谱第三节 高效毛细管电泳（HPCE）基本原理：在毛细管内实现的电泳技术在毛细管内实现的电泳技术40所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。2.高效毛细管电泳技术上的重要突破1）采用了0.05mm内径的毛细管2）采用了高达数千伏的电压3）柱效远高于HPLC色谱经典电泳与高效毛细管电泳1.经典电泳分离法的不足41HPCE的特点：高效（每米塔板数为十万、百万、千万）高速（几十秒内完成）高灵敏度（10-1910-21mol）样品用量少（纳升）应用范围广（无机离子到整个细胞）重现

14、重现性好性好进样准确性高准确性高42HPCE的基本工作原理溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。43缓冲液充满毛细管柱进样端换上样品池，进样换回缓冲液池各组分淌度和分配差异而实现分离紫外或激光诱导荧光检测器分析流程仪器装置施加高压电压数据记录与处理系统色谱图44030KV; 200300A高压电源：毛细管柱：石英材料; 内径为2575m紫外或激光诱导荧光检测器检测器：进样技术：电动进样（电迁移进样）气动进样（压差进样）进样端加压出口端减压虹吸作用45毛细管电泳的分离模式v1.毛细管区

15、带电泳 （CZEv2.毛细管凝胶电泳 CGEv3.毛细管胶束电动色谱（MECC)v4.毛细管电色谱（CEC461.毛细管区带电泳整个系统都用同一种缓冲溶液充满。背景电解质的浓度一般高于试样，起运载电流的作用，其离子有一定的迁移率。小分子离子，生物大分子或反应生成离子的物质基于试样中各个组分间荷质比的差异47毛细管种类 非涂层毛细管（裸管） 内壁涂层毛细管（涂层管）(聚乙烯醇类(PVA) 涂层毛细管/CEP 涂层毛细管)-+EOF0tm (min) Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection z

16、one Minimizes band broadening Narrows detection zone电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用 正面作用正面作用 增加分离速度增加分离速度 使得正、负电荷物使得正、负电荷物质同时分离质同时分离 负面作用负面作用 减少分离时间和分减少分离时间和分离有效距离离有效距离 电渗流的波动极大电渗流的波动极大的影响了迁移时间的影响了迁移时间的重复性的重复性影响电渗流的因素 pH值 pH越高，电渗流越大 离子强度 离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随pH的变化情况控制电渗流的三个重要手段1. 采

17、用涂层毛细管，消除电渗流的影响2. 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH10以后，电渗流基本不增加3. 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用缓冲溶液的影响和选择 在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液：1. 在所选的pH范围内有较强缓冲能力；2. 在检测波长处有低的紫外吸收；3. 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点

18、是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的CE缓冲体系 磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系 2.毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。 用于核酸片断及蛋白分子量分析CE双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控寡核苷酸质控 1.0 2.0 3.0123 456789101112131415161718192023242526272829303031323334IS21 10.0 15

19、.0Relative Fluorescence IntensitydsDNA片段片段 (72 bp-12 Kbp)CE-SDS蛋白分子量分析3.毛细管胶束电动色谱按淌度和疏水性不同进行分离61中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离 ，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。毛细管胶束电动色谱原理SDS-+EOFMicellar Electrokinetic Chromatogra

20、phy (MEKC)七种青霉素的分离(A) CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点 优点 增加对弱极性物质分离的分离度 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用 缺点 稳定性不佳，达到好的重复性比较困难 4.毛细管电色谱(CEC)v利用电渗驱动电渗驱动溶剂通过高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。67v能够分离不带电荷的物质。v不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。简化了输送体系。v电渗泵产生的是电渗泵

21、产生的是塞子式塞子式流动轮廓，而不是流体动力流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色谱法高。色谱法高。特点：68 1. DNA分析 DNA分析包括碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸、引物、探针、单链DNA、双链DNA(DNA片段、PCR产物)分析及DNA序列测定。CZE和MECC通常用来分离碱基、核苷酸、简单的核苷酸等。CGE则用于较大的寡核苷酸、ssDNA、dsDNA和DNA序列分析。已有CE测定DNA序列的商品仪器面市，但快速测定DNA序列仍在研究中。69第四节第四节 毛细管电泳的应用与发展动向毛细管电泳的应用与发展动向

22、2. 肽和蛋白分析 CE在生物大分子蛋白和肽的应用可概括为两大方面：一是其结构的表征，二是研究相互作用。CE已广泛用作最有效的纯度检测手段，它可检测出多肽链上单个氨基酸的差异。用CIEF测定等电点，分辨度可达0.01pH单位。肽谱用CE/MS联用进行分析，可推断蛋白的分子结构。用CE进行蛋白本身反应及和小分子相互作用研究是研究热点，蛋白和DNA分析始终是CE研究的重点，今后会有更多的研究。70 3.手性分离 手性对映体分离、鉴定有巨大的应用价值，已成为医药领域内一个重要课题。除CIEF外，其余五种模式均可用于手性分离。CE进行手性分离，通常均在运行缓冲液内加入手性选择剂，在操作及分离效率上均优

23、于HPLC手性分离。今后CE手性分离将会在发展更多手性选择剂、更深入地探讨分离机理及手性药物在体内的作用及代谢等方面开展研究。71 4.药物分析和临床检测 目前CE在药物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段，但在医药领域尚未确定为法定方法，故未得到广泛使用。医药领域内大量研究工作表明CE正在走向成熟。而CE/MS联用也将促进CE快速发展。CE在临床化学中除进行临床分子生物学测定外，也广泛用于疾病临床诊断、临床蛋白分析、临床药物监测和药物代谢研究。药物代谢研究对CE是一个挑战，虽有不少成功报道，但在提高灵敏度、解决蛋白吸附等方面仍待改进。72 5.环境监测和离子分析 CE在环境监测中的应用也日

24、趋增多，目前主要集中在用各种模式，包括CEC分离监测土壤等环境中的多环芳烃(PAHs)，可在10min内分离16种多环芳烃。CE在环境监测中应用还需提高灵敏度和发展浓缩、富集方法。CE较重要的应用还有糖的分析，目前最成功的是用APTS作糖的衍生化试剂，标记后用LIF可进行单糖和多糖的测定。73 6.单细胞、单分子监测 单细胞、单分子检测是CE研究达到的最高境界，对生命科学和化学有巨大潜在意义单细胞监测或许会对细胞水平的药理学、了解生命过程提供一种活体检测手段。单个DNA分子的检测早有报道，最近EYeung报道用CE监测单个蛋白分子，是一突破性的进展，表明科学家向研究单分子间的各种化学和生物反应跨出了决定性的一步。74 7.毛细管电